[發(fā)明專利]一種氧化型低密度脂蛋白的制備方法及應(yīng)用技術(shù)

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010109973.0
• 申請日: 2010-02-03
• 公開（公告）號: CN101787076A
• 公開（公告）日: 2010-07-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宮海濱;徐鎖平;蘇景力;王潔;龐慧;李春梅
• 申請（專利權(quán)）人: 徐州市心血管病研究所
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;G01N33/53;G01N1/28;G01N1/30;G01N1/42
• 代理公司: 徐州市三聯(lián)專利事務(wù)所 32220
• 代理人: 何君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種低密度脂蛋白的制備方法，具體涉及一種氧化型低密度脂蛋白的制備方法及應(yīng)用，屬醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

心肌纖維化是指心肌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中膠原纖維過量積聚、膠原濃度顯著升高或膠原成分發(fā)生改變。它是膠原合成代謝和降解代謝失衡的結(jié)果，這種病理變化在肥厚性心肌病、心力衰竭等多種心血管疾病中存在，現(xiàn)認(rèn)為其與心律失常、心功能障礙甚至心源性猝死密切相關(guān)。心肌纖維化是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，長期的壓力超負(fù)荷、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等是其主要原因，涉及到神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等。上述刺激因素均會引起內(nèi)源性的心臟旁/自分泌系統(tǒng)的調(diào)控紊亂，這些旁/自分泌系統(tǒng)不僅誘導(dǎo)心肌損傷，也是心肌纖維化的促進(jìn)因子。隨著人口老齡化的進(jìn)展，心肌纖維化越來越引起了人們的重視，因此，發(fā)現(xiàn)心肌纖維化危險(xiǎn)因素及對其機(jī)制的研究愈發(fā)顯得重要。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)在體內(nèi)由低密度脂蛋白(LDL)經(jīng)氧自由基氧化而來，它對心血管系統(tǒng)有著廣泛影響：在泡沫細(xì)胞形成過程中起關(guān)鍵作用；誘導(dǎo)單核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和向內(nèi)皮下的趨化；促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖退化；促進(jìn)血小板粘附、聚集、血栓形成；加劇心臟和血管的炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生血小板衍生生長因子(PDGF)，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞移行；損傷內(nèi)皮細(xì)胞等。Cucina?A等研究發(fā)現(xiàn)氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)能刺激平滑肌細(xì)胞分泌bFGF，刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌TGF-β1，提示ox-LDL在心肌纖維化過程中可能起到重要作用，尤其是重新認(rèn)識強(qiáng)化降脂治療，及阻斷ox-LDL的信號通路可以作為防治心肌纖維化的措施之一，對于臨床治療具有現(xiàn)實(shí)意義，目前國內(nèi)外均處于研究階段。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種氧化型低密度脂蛋白的制備方法及應(yīng)用技術(shù)，該方法通過對氧化型低密度脂蛋白的提取與鑒定、ox-LDL體外促進(jìn)心肌纖維化的研究，利用本發(fā)明提取的氧化型低密度脂蛋白對心肌纖維化的作用，探索心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制，阻斷其信號通路可促進(jìn)抗心肌纖維化藥物的研發(fā)。

本發(fā)明是以如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種氧化型低密度脂蛋白的制備方法，其特征是：它包括提取正常人血清，經(jīng)高速離心機(jī)離心，去除上層乳糜微粒后調(diào)節(jié)密度，超速離心機(jī)離心兩次，取上層低密度脂蛋白，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，然后用氧化劑氧化得到氧化型低密度脂蛋白，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及MDA試劑盒測氧化值，BCA法測定蛋白濃度。

所述的催化氧化為用硫酸銅催化氧化，濃度為1～10μmol·L^-1。

所述的BCA法測定蛋白濃度是將大鼠分離的心肌細(xì)胞分別培養(yǎng)在90個(gè)培養(yǎng)皿中(每皿含培養(yǎng)液2mL)，培養(yǎng)密度為2×10⁵個(gè)心肌細(xì)胞/皿，隨機(jī)選30個(gè)培養(yǎng)皿為空白對照組(其中加入相應(yīng)體積的PBS緩沖液使低密度脂蛋白、氧化型低密度脂蛋白終濃度為0μg·mL^-1)，分別孵育0h、6h、12h、24h、48h；再選30皿為低密度脂蛋白對照組(加入低密度脂蛋白使其終濃度為120μg·mL^-1)，分別孵育0h、6h、12h、24h、48h；其余30皿為實(shí)驗(yàn)組(加入氧化型低密度脂蛋白使其終濃度為120μg·mL^-1)，分別孵育0h、6h、12h、24h、48h，用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TGF-β1和bFGF濃度，留取細(xì)胞培養(yǎng)上清，在3000轉(zhuǎn)/min下離心10min后凍存于-80℃，用ELISA試劑盒檢測各組培養(yǎng)液中的TGF-β1、bFGF濃度。。

所述的氧化型低密度脂蛋白的應(yīng)用技術(shù)，其特征是：將PBS緩沖液、低密度脂蛋白及氧化型低密度脂蛋白經(jīng)大鼠尾靜脈注入其血管內(nèi)，每天注射一次，空白對照組中注射相應(yīng)體積的PBS緩沖液，實(shí)驗(yàn)組注射氧化型低密度脂蛋白(血漿中終濃度為40μg·mL^-1)，低密度脂蛋白對照組中注射相同濃度的低密度脂蛋白。分別于第1、7、14、21及28天，在麻醉狀態(tài)下取出實(shí)驗(yàn)大鼠心臟，用冰凍生理鹽水沖洗干凈，取心室肌放入4％多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為5μm，每個(gè)石蠟塊取10張切片進(jìn)行Masson染色，普通光鏡觀察形態(tài)學(xué)改變，圖像采用Image?pro?plus?6.0圖像分析處理軟件手動計(jì)算綠色纖維和紅色膠原的面積，計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)，用ELISA法檢測血漿中P?I?CP濃度，分別于第1、7、14、21及28天采血，在3000轉(zhuǎn)/min下離心10min后得到血漿，-80℃凍存，用ELISA試劑盒檢測血漿P?I?CP濃度。