[發明專利]海水養殖池塘底泥微生物基因組DNA的提取方法

無效

• 申請號: 201010109576.3
• 申請日: 2010-02-20
• 公開（公告）號: CN102161987A
• 公開（公告）日: 2011-08-24
• 發明（設計）人: 常亞青;王軼南;丁君;宋堅;朱世偉;劉艷萍
• 申請（專利權）人: 大連水產學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 閃紅霞

技術領域：

本發明涉及分子生態學領域，尤其是一種操作方法簡單，在一般實驗室即可快速、方便地得到大片段微生物基因組總DNA樣品的海水養殖池塘中底泥微生物基因組DNA的提取方法。

背景技術：

底泥微生物是養殖池塘生態系統中的重要組成部分，直接影響池塘中養殖動物尤其是底棲生活習性動物的生長，其組成結構可為指導健康養殖及衡量養殖環境優劣提供科學依據。然而，由于底泥微生物中僅有1％的可培養菌，因此必需獲得高質量、多樣性程度高、具有代表性的底泥微生物DNA，才能分析出養殖環境的菌群組成結構。目前，在對自然生境中的土壤、污泥中的微生物多樣性研究中，已嘗試采用溶菌酶、超聲波法及玻璃珠等DNA提取方法，并在提取過程中應用PVPP、CTAB等去除腐植酸、粘粒等嚴重影響后續分子操作的物質。然而，因海水養殖池塘地處潮間帶的特殊環境，加之有餌料碎屑、養殖動物糞便等沉積，使底泥的組成比自然生境的土壤、污泥更為復雜，迄今為止，還沒有關于海水養殖池塘底泥微生物基因組DNA提取方法的相關報道。

發明內容：

本發明的目的是為了提供一種操作方法簡單，在一般實驗室即可快速、方便地得到大片段微生物基因組總DNA樣品的海水養殖池塘中底泥微生物基因組DNA的提取方法。

本發明的技術解決方案是：

一種海水養殖池塘底泥微生物基因組DNA的提取方法，依次按照如下步驟進行：

a.取0.3～0.5g底泥樣品于離心管中，加入800～1000μl預處理緩沖液，渦旋混勻；所述預處理緩沖液為100μl?pH?5.5的1M?Tris-HCl?buffer、700μl超純水以及200μl?0.2M?Al₂(SO4)₃的混合溶液；

b.用4M?NaOH調a步驟所得溶液的pH至8，3500g×2min離心棄上清，取沉淀；

c.向所得沉淀中加入300～400μl濃度為5mg/ml的溶菌酶渦旋混勻，再加入100～120μl濃度為10％的SDS、15～25ul?25mg/ml蛋白酶K，渦旋混勻；

d.加入200～400μl?5M?NaCl渦旋混勻，加入180～280μl?65℃預熱的CTAB-NaCl，渦旋混勻，65℃作用20min后11,000g×1min離心取上清；

e.在上清液中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，渦旋混勻，11,000g×15min離心取上清，酚/氯仿/異戊醇的體積比為25∶24∶1；

f.加入等體積的氯仿/異戊醇渦旋混勻，氯仿/異戊醇的體積比為24∶1，11,000g×15min離心取上清；

g.重復步驟f一次；

h.將上清移至1.5ml離心管，加入0.7倍體積異丙醇、0.1倍體積5MNaCl，室溫過夜，18,000g×30min離心棄上清，向沉淀中加入1ml預冷70％乙醇重懸、洗滌；

i.18,000g×30min離心后棄除上清，干燥沉淀，加入30～50μl?1×TE，4℃溶解至少4h。

本發明可在一般實驗室快速、方便地得到大片段的池塘底泥微生物群落的總DNA樣品，獲得的底泥基因組DNA純度大于1.6(OD₂₆₀/OD₂₈₀)，片斷大于20Kb，適合作為DGGE(變性梯度凝膠電泳)指紋分析池塘底泥微生物種群結構與多樣性的16S?rDNA-PCR擴增的高質量模板，同時也適合作為基因文庫構建的樣品DNA，為指導海水池塘健康養殖及衡量養殖環境優劣提供科學依據。

附圖說明：

圖1為本發明實施例1、2所提取的海水養殖池塘底泥微生物總DNA模板的瓊脂糖凝膠圖。

圖2為以本發明實施例1、2所提取的海水養殖池塘底泥微生物總DNA為模板16S?rDNA-PCR擴增產物的瓊脂糖電泳檢測圖。

圖3為以本發明實施例1、2所提取的海水養殖池塘底泥微生物總DNA為模板16S?rDNA-PCR擴增產物的DGGE圖譜。

具體實施方式：

實施例1：

a.使用滅菌藥匙刮除大連黑石礁養殖池塘表面底泥后，采集深2～3cm處底泥約20g放入滅菌廣口玻璃瓶，使用滅菌藥匙于無菌操作臺內充分攪拌、混合底泥，取0.3g樣品于離心管中，加入800μl預處理緩沖液，渦旋混勻3min，預處理緩沖液為100μl?pH?5.5的1M?Tris-HCl?buffer、700μl超純水以及200μl?0.2MAl₂(SO4)₃的混合溶液；