[發明專利]海水養殖池塘底泥微生物基因組DNA的提取方法

無效

• 申請號: 201010109576.3
• 申請日: 2010-02-20
• 公開（公告）號: CN102161987A
• 公開（公告）日: 2011-08-24
• 發明（設計）人: 常亞青;王軼南;丁君;宋堅;朱世偉;劉艷萍
• 申請（專利權）人: 大連水產學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 閃紅霞

1.一種海水養殖池塘底泥微生物基因組DNA的提取方法，依次按照如下步驟進行：

a.取0.3～0.5g底泥樣品于離心管中，加入800～1000μl預處理緩沖液，渦旋混勻；所述預處理緩沖液為100μl?pH?5.5的1M?Tris-HCl?buffer、700μl超純水以及200μl?0.2M?Al₂(SO₄)₃的混合溶液；

b.用4M?NaOH調a步驟所得溶液的pH至8，3500g×2min離心棄上清，取沉淀；

c.向所得沉淀中加入300～400μl濃度為5mg/ml的溶菌酶渦旋混勻，再加入100～120μl濃度為10％的SDS、15～25ul?25mg/ml蛋白酶K，渦旋混勻；

d.加入200～400μl?5M?NaCl渦旋混勻，加入180～280μl?65℃預熱的CTAB-NaCl，渦旋混勻，65℃作用20min后11,000g×1min離心取上清；

e.在上清液中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，渦旋混勻，11,000g×15min離心取上清，酚/氯仿/異戊醇的體積比為25∶24∶1；

f.加入等體積的氯仿/異戊醇渦旋混勻，氯仿/異戊醇的體積比為24∶1，11,000g×15min離心取上清；

g.重復步驟f一次；

h.將上清移至1.5ml離心管，加入0.7倍體積異丙醇、0.1倍體積5M?NaCl，室溫過夜，18,000g×30min離心棄上清，向沉淀中加入1ml預冷70％乙醇重懸、洗滌；

i.18,000g×30min離心后棄除上清，干燥沉淀，加入30～50μl1×TE，4℃溶解至少4h。