[發明專利]大豆血紅蛋白基因提高萊茵衣藻生物制氫產量的方法

無效

• 申請號: 201010107922.4
• 申請日: 2010-02-09
• 公開（公告）號: CN101845461A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 吳雙秀;閻光宇;許麗麗;黃瑞;王榮榮;王全喜
• 申請（專利權）人: 上海師范大學
• 主分類號: C12P3/00
• 分類號: C12P3/00;C12N15/29;C12N15/63;C12N1/13;C12R1/89
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 楊杰民

技術領域

本發明屬于生物制氫技術，具體地說是大豆血紅蛋白基因提高萊茵衣藻生物制氫產量的方法。

背景技術

能源短缺和環境污染成為當代人類社會發展面臨的兩大難題，開發和利用清潔能源迫在眉睫。氫氣能量密度高，燃燒后只產生水、不產生具有溫室效應的CO₂和其它有毒氣體，對環境無污染，是一種極具開發潛力的理想清潔能源。現有技術制備氫氣的方法是通過水電解制備氫，但是這種方法耗費電能，實際上是以電能換取氫氣能源。生物制氫是解決氫氣來源可持續生產問題的重要途徑之一。萊茵衣藻(Chlamydomonas?reinhardtii)是一種單細胞綠藻，其氫酶(H₂ase)基因在厭氧條件下被誘導表達，能將光合作用中產生的H⁺和e^-合成H₂，釋放到細胞外，是利用太陽能生產氫氣的理想方法。萊茵衣藻生長速度快，培養成本低，其氫酶活性高，是有極大潛力的微藻光合制氫藻種。但是萊茵衣藻氫酶對氧氣敏感，很容易受氧氣的抑制而失去活性；而氧氣又是衣藻光合作用的主要產物。這一對矛盾限制了衣藻的產氫效果，限制了衣藻產氫技術的應用。因此，為了提高衣藻光合產氫效率，需要盡可能的降低衣藻細胞內的氧氣含量。目前降低衣藻細胞內的氧氣含量的辦法是通過抑制光合系統II(PS?II)的活性，從而實現抑制光解水放氧，但是該方法同時抑制了光合鏈電子傳遞效率，影響了衣藻的產氫效率；另一方面，缺氧條件下衣藻的生長受到嚴重抑制，最終影響了產氫效率。

豆科植物根瘤中的固氮酶有很高的固氮活性，與根瘤細胞中含有大量的豆血紅蛋白(leghemoglobin，簡稱Lb)有密切關系。豆血紅蛋白具有與氧氣可逆結合、降低細胞內氧濃度和調節呼吸作用的特性，既能維持根瘤細胞內較低的氧氣含量，又能保障呼吸作用需要的氧氣和固定空氣中氮素需要的能量。

豆血紅蛋白有兩個亞基構成，一個是球蛋白亞基，由豆科植物合成；另一個是血紅素輔基，由共生的根瘤菌合成。兩個亞基結合成為有活性的豆血紅蛋白。在植物細胞內、尤其是在葉綠體中，血紅素輔基前體可以通過葉綠素合成途徑合成。植物葉綠體中，原撲啉在鎂螯合酶的作用下生成葉綠素；在根瘤細胞中，原撲啉在根瘤菌合成的亞鐵螯合酶催化下合成血紅素輔基。植物細胞中存在著具有與亞鐵螯合酶相似功能和相似結構的吡啶核苷酸二硫酸氧化還原酶(pyridine-nucleotide?disulfide?oxidoreductase)的蛋白酶家族。

本發明針對衣藻產氫培養需要無氧條件的關鍵問題，利用來源于大豆(Glycine?max)根瘤的豆血紅蛋白球蛋白亞基基因lba，解決衣藻產氫代謝過程中需要盡量降低細胞內氧氣含量又盡量保證其正常代謝的技術難題。

發明內容：

本發明的目的在于提供一種利用豆血紅蛋白球蛋白亞基基因lba，解決萊茵衣藻產氫中降低細胞內氧氣含量，提高氫化酶活性，又能保障呼吸作用需要的氧氣的技術方法。

本發明的目的是這樣實現的：

1、大豆血紅蛋白基因提高萊茵衣藻生物制氫產量的方法，步驟如下：

(1)萊茵衣藻的培養：

A、選細胞壁缺欠型萊茵衣藻藻種cc849；

B、培養萊茵衣藻藻種：

(a)液體培養基：溫度25±1℃；日光燈光照強度100～200微摩爾光量子/平方米·秒(μmol?photonsm^-2s^-1)；50～100ml三羥甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸鹽(Tris-Acetate-Phosphate簡稱TAP)培養基液體培養，初始pH7.2，水平搖床轉速100～130rpm，每5～6天1％接種繼代培養；

(b)固體平板TAP培養基：瓊脂粉1.5％；挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過劃線方法接種在平板上保存和純化藻種，每3周繼代一次；

C、產氫培養條件：在缺硫培養基中進行，把正常的TAP培養基的硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸銅和硫酸鋅分別換為等摩爾的氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅；將生長至對數期后期的萊茵衣藻3000rpm室溫離心5min，收集藻細胞并用缺硫培養基洗3次，懸浮在缺硫培養基內，分別裝在培養瓶內，培養瓶上方留10ml的空間，用翻口橡皮塞密閉；黑暗條件下培養24小時，然后放在連續光照件下培養，光照強度50～100微摩爾光量子/平方米·秒(μmol?photons?m^-2s^-1)，溫度25±1℃；每24小時進行氣體成分和含量檢測一次；