[發(fā)明專利]大豆血紅蛋白基因提高萊茵衣藻生物制氫產(chǎn)量的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010107922.4
• 申請(qǐng)日: 2010-02-09
• 公開（公告）號(hào): CN101845461A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳雙秀;閻光宇;許麗麗;黃瑞;王榮榮;王全喜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P3/00
• 分類號(hào): C12P3/00;C12N15/29;C12N15/63;C12N1/13;C12R1/89
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31227
• 代理人: 楊杰民

1.大豆血紅蛋白基因提高萊茵衣藻生物制氫產(chǎn)量的方法，步驟如下：

(1)萊茵衣藻的培養(yǎng)：

A、選細(xì)胞壁缺欠型萊茵衣藻藻種cc849；

B、培養(yǎng)萊茵衣藻藻種：

(a)液體培養(yǎng)基：溫度25±1℃；日光燈光照強(qiáng)度100～200微摩爾光量子/平方米.秒(μmol?photons?m^-2s^-1)；50～100ml三羥甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸鹽(Tris-Acetate-Phosphate簡(jiǎn)稱TAP)培養(yǎng)基液體培養(yǎng)，初始pH7.2，水平搖床轉(zhuǎn)速100～130rpm，每5～6天1％接種繼代培養(yǎng)；

(b)固體平板TAP培養(yǎng)基：瓊脂粉1.5％；挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過(guò)劃線方法接種在平板上保存和純化藻種，每3周繼代一次；

C、產(chǎn)氫培養(yǎng)條件：在缺硫培養(yǎng)基中進(jìn)行，把正常的TAP培養(yǎng)基的硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸銅和硫酸鋅分別換為等摩爾的氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅；將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后期的萊茵衣藻3000rpm室溫離心5min，收集藻細(xì)胞并用缺硫培養(yǎng)基洗3次，懸浮在缺硫培養(yǎng)基內(nèi)，分別裝在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)瓶上方留10ml的空間，用翻口橡皮塞密閉；黑暗條件下培養(yǎng)24小時(shí)，然后放在連續(xù)光照件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度50～100微摩爾光量子/平方米·秒(μmol?photons?m^-2s^-1)，溫度25±1℃；每24小時(shí)進(jìn)行氣體成分和含量檢測(cè)一次；

D、用GC測(cè)定氫氣和氧氣含量：氣相色譜儀為美國(guó)Agilent?Technologies公司生產(chǎn)的7890A型號(hào)，分子篩51/8(OD)，柱長(zhǎng)2m，內(nèi)徑3mm，熱導(dǎo)檢測(cè)器TCD，以氬氣作為載氣。進(jìn)樣體積0.5ml，柱溫50℃，進(jìn)樣溫度200℃，熱導(dǎo)檢測(cè)溫度300℃；

(2)豆血紅蛋白球蛋白亞基1ba基因的克隆：

A、取大豆成熟的根瘤液氮研磨，提取大豆的總RNA；用DNA水解酶DNase?I37℃水浴30min，去除RNA中混雜的DNA；加入25mM乙二胺四乙酸，65℃水浴10min，終止DNA水解酶的活性；37℃水浴60min合成單鏈cDNA；

B、用DNA聚合酶(ExTag)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)克隆大豆1ba基因，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，一個(gè)循環(huán)；94℃變性1min，62℃退火30s，72℃延伸1min；共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，反應(yīng)產(chǎn)物純化回收；

C、測(cè)序鑒定1ba基因的特異性引物：

Lba-P1：5’-c?gag?ctcaaa?ttt?aaa?ttt?atg?gtt?gct?ttc?act?gag-3’，斜體表示限制性內(nèi)切酶SmalI的酶切位點(diǎn)序列，方框中的序列是加入的增強(qiáng)翻譯能力的核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS序列；

Lba-P2：5’-tcc?ccc?ggg?ata?cta?att?atg?cct?tct?taa?tag?c-3’，斜體表示限制性內(nèi)切酶SacI酶切位點(diǎn)序列；

(3)萊茵衣藻葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建：

用限制性內(nèi)切酶SmalI和SacI來(lái)酶切克隆得到的大豆1ba基因片段和葉綠體表達(dá)載體cg40；將1ba基因片段用T4?DNA連接酶連接在質(zhì)粒cg40中的壯觀霉素抗性基因aadA之后形成aadA-1ba融合基因，得到衣藻葉綠體表達(dá)載體cg401-1-1ba，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶SmalI和SacI雙酶切鑒定，得到442bp的1ba片段和5900bp的質(zhì)粒片段；

(4)萊茵衣藻葉綠體的轉(zhuǎn)化：

A、取100ml對(duì)數(shù)期中后期的萊茵衣藻，25℃下3000rpm離心5min收集藻細(xì)胞，用新鮮TAP洗三次，涂于新鮮TAP固體平板上；光照100微摩爾光量子/平方米·秒(μmol?photons·m^-2·s^-1)和25±1℃條件下培養(yǎng)24小時(shí)；用基因搶轟擊轉(zhuǎn)化；真空度9.48192×10⁴Pa，轟擊距離9cm，氦氣壓力7.584236×10⁶Pa，金粉子彈經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切質(zhì)粒cg401-1-1ba?DNA包裹，金粉子彈顆粒直徑1.0微米；

B、轉(zhuǎn)化后的衣藻在光照和25±1℃條件下，過(guò)渡培養(yǎng)18h，用TAP液體培養(yǎng)基沖洗，涂布于含壯觀霉素100μg/ml的TAP固體選擇培養(yǎng)基上，在25±1℃和100微摩爾光量子/平方米·秒(μmol?photons·m^-2·s^-1)的連續(xù)光照條件下，培養(yǎng)約7～15天；取有抗性的單藻落分別在選擇培養(yǎng)基上多次繼代培養(yǎng)；分別進(jìn)行產(chǎn)氫培養(yǎng)，并檢測(cè)產(chǎn)氫量和耗氧量；

(5)轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中1ba基因的整合及其表達(dá)：

A、1ba基因整合到萊茵衣藻葉綠體DNA的檢測(cè)：

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期衣藻培養(yǎng)液，4℃低速離心收集，加入350μlNET的0.1mol/L氯化鈉，50mmol/L乙二胺四乙酸，pH值8.020mmol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸重懸沉淀，加入25μl10mg/ml的蛋白酶K及25μl?20％十二烷基硫酸鈉(SDS)，混合均勻，37℃水浴12小時(shí)，冷卻；加入200μl?5mol/L醋酸鉀(KAc)，冰上靜置、離心，上清液中加入等體積的25∶24∶1酚/氯仿/異戊醇抽提2次；再用等體積的氯仿抽提1次；總DNA用無(wú)水乙醇沉淀和70％乙醇洗滌，干燥后溶于30μl三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA，簡(jiǎn)稱TE)緩沖液；

B、轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中1ba基因轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)：

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期的萊茵衣藻，室溫3000rpm離心5分鐘收集藻細(xì)胞；提取萊茵衣藻的總RNA和合成cDNA；利用上述1ba基因的特異性引物和上述克隆1ba基因所述的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行1ba基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)，得到442bp的擴(kuò)增條帶；

C、轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中Lba表達(dá)量的檢測(cè)：

取產(chǎn)氫培養(yǎng)的萊茵衣藻培養(yǎng)液，室溫3000rpm快速離心5min收集藻細(xì)胞，用250μl蛋白提取緩沖液懸浮，加入2μlβ-巰基乙醇，液氮凍融三次；在4℃條件下，14000g離心20min，取100μg的蛋白上清液加上0.25摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸配制的緩沖液(Tris-HCl)，pH?8.0；25％甘油；7.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)；0.25mg/ml溴酚蘭(bromophenolblue)；12.5％(v/v)β-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)于10％的分離膠和5％的濃縮膠進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜，抗大豆Lba多克隆抗體進(jìn)性免疫雜交檢測(cè)，對(duì)辣根過(guò)氧化酶(Horseradish?Peroxidase，簡(jiǎn)稱HRP)標(biāo)記的抗體進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)；

(6)分析重組豆血紅蛋白球蛋白亞基Lba對(duì)萊茵衣藻生長(zhǎng)的影響：

A、用TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計(jì)檢測(cè)萊茵衣藻在750nm處的吸光度；

B、取藻液3000rpm離心5min收集藻細(xì)胞，加入同體積的95％乙醇溶液，混合均勻，室溫避光放置20min，4℃下12000rpm離心10min；取上清，測(cè)定OD665及D649的吸光值；

C、計(jì)算葉綠素a，葉綠素b及總?cè)~綠素的含量，單位mg/L：葉綠素Chl(mg/l)＝20.04(OD₆₄₉)+6.10(0D₆₆₅)；

(7)分析豆血紅蛋白球蛋白亞基Lba對(duì)萊茵衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)的耗氧量和產(chǎn)氫量的影響：

A、缺硫培養(yǎng)基中耗氧量和產(chǎn)氫量的檢測(cè)：

B、含硫培養(yǎng)基中對(duì)耗氧量和產(chǎn)氫量的檢測(cè)。