[發明專利]大豆血紅蛋白基因提高萊茵衣藻生物制氫產量的方法

無效

• 申請號: 201010107922.4
• 申請日: 2010-02-09
• 公開（公告）號: CN101845461A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 吳雙秀;閻光宇;許麗麗;黃瑞;王榮榮;王全喜
• 申請（專利權）人: 上海師范大學
• 主分類號: C12P3/00
• 分類號: C12P3/00;C12N15/29;C12N15/63;C12N1/13;C12R1/89
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 楊杰民

1.大豆血紅蛋白基因提高萊茵衣藻生物制氫產量的方法，步驟如下：

(1)萊茵衣藻的培養：

A、選細胞壁缺欠型萊茵衣藻藻種cc849；

B、培養萊茵衣藻藻種：

(a)液體培養基：溫度25±1℃；日光燈光照強度100～200微摩爾光量子/平方米.秒(μmol?photons?m^-2s^-1)；50～100ml三羥甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸鹽(Tris-Acetate-Phosphate簡稱TAP)培養基液體培養，初始pH7.2，水平搖床轉速100～130rpm，每5～6天1％接種繼代培養；

(b)固體平板TAP培養基：瓊脂粉1.5％；挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過劃線方法接種在平板上保存和純化藻種，每3周繼代一次；

C、產氫培養條件：在缺硫培養基中進行，把正常的TAP培養基的硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸銅和硫酸鋅分別換為等摩爾的氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅；將生長至對數期后期的萊茵衣藻3000rpm室溫離心5min，收集藻細胞并用缺硫培養基洗3次，懸浮在缺硫培養基內，分別裝在培養瓶內，培養瓶上方留10ml的空間，用翻口橡皮塞密閉；黑暗條件下培養24小時，然后放在連續光照件下培養，光照強度50～100微摩爾光量子/平方米·秒(μmol?photons?m^-2s^-1)，溫度25±1℃；每24小時進行氣體成分和含量檢測一次；

D、用GC測定氫氣和氧氣含量：氣相色譜儀為美國Agilent?Technologies公司生產的7890A型號，分子篩51/8(OD)，柱長2m，內徑3mm，熱導檢測器TCD，以氬氣作為載氣。進樣體積0.5ml，柱溫50℃，進樣溫度200℃，熱導檢測溫度300℃；

(2)豆血紅蛋白球蛋白亞基1ba基因的克隆：

A、取大豆成熟的根瘤液氮研磨，提取大豆的總RNA；用DNA水解酶DNase?I37℃水浴30min，去除RNA中混雜的DNA；加入25mM乙二胺四乙酸，65℃水浴10min，終止DNA水解酶的活性；37℃水浴60min合成單鏈cDNA；

B、用DNA聚合酶(ExTag)進行聚合酶鏈式反應(PCR)克隆大豆1ba基因，反應條件：94℃預變性5min，一個循環；94℃變性1min，62℃退火30s，72℃延伸1min；共30個循環；72℃延伸10min，反應產物純化回收；

C、測序鑒定1ba基因的特異性引物：

Lba-P1：5’-c?gag?ctcaaa?ttt?aaa?ttt?atg?gtt?gct?ttc?act?gag-3’，斜體表示限制性內切酶SmalI的酶切位點序列，方框中的序列是加入的增強翻譯能力的核糖體結合位點RBS序列；

Lba-P2：5’-tcc?ccc?ggg?ata?cta?att?atg?cct?tct?taa?tag?c-3’，斜體表示限制性內切酶SacI酶切位點序列；

(3)萊茵衣藻葉綠體表達載體的構建：

用限制性內切酶SmalI和SacI來酶切克隆得到的大豆1ba基因片段和葉綠體表達載體cg40；將1ba基因片段用T4?DNA連接酶連接在質粒cg40中的壯觀霉素抗性基因aadA之后形成aadA-1ba融合基因，得到衣藻葉綠體表達載體cg401-1-1ba，轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒，經限制性內切酶SmalI和SacI雙酶切鑒定，得到442bp的1ba片段和5900bp的質粒片段；

(4)萊茵衣藻葉綠體的轉化：

A、取100ml對數期中后期的萊茵衣藻，25℃下3000rpm離心5min收集藻細胞，用新鮮TAP洗三次，涂于新鮮TAP固體平板上；光照100微摩爾光量子/平方米·秒(μmol?photons·m^-2·s^-1)和25±1℃條件下培養24小時；用基因搶轟擊轉化；真空度9.48192×10⁴Pa，轟擊距離9cm，氦氣壓力7.584236×10⁶Pa，金粉子彈經限制性內切酶EcoRI酶切質粒cg401-1-1ba?DNA包裹，金粉子彈顆粒直徑1.0微米；

B、轉化后的衣藻在光照和25±1℃條件下，過渡培養18h，用TAP液體培養基沖洗，涂布于含壯觀霉素100μg/ml的TAP固體選擇培養基上，在25±1℃和100微摩爾光量子/平方米·秒(μmol?photons·m^-2·s^-1)的連續光照條件下，培養約7～15天；取有抗性的單藻落分別在選擇培養基上多次繼代培養；分別進行產氫培養，并檢測產氫量和耗氧量；

(5)轉基因萊茵衣藻中1ba基因的整合及其表達：

A、1ba基因整合到萊茵衣藻葉綠體DNA的檢測：

取對數生長后期衣藻培養液，4℃低速離心收集，加入350μlNET的0.1mol/L氯化鈉，50mmol/L乙二胺四乙酸，pH值8.020mmol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸重懸沉淀，加入25μl10mg/ml的蛋白酶K及25μl?20％十二烷基硫酸鈉(SDS)，混合均勻，37℃水浴12小時，冷卻；加入200μl?5mol/L醋酸鉀(KAc)，冰上靜置、離心，上清液中加入等體積的25∶24∶1酚/氯仿/異戊醇抽提2次；再用等體積的氯仿抽提1次；總DNA用無水乙醇沉淀和70％乙醇洗滌，干燥后溶于30μl三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA，簡稱TE)緩沖液；

B、轉基因萊茵衣藻中1ba基因轉錄的檢測：

取對數生長期中期的萊茵衣藻，室溫3000rpm離心5分鐘收集藻細胞；提取萊茵衣藻的總RNA和合成cDNA；利用上述1ba基因的特異性引物和上述克隆1ba基因所述的PCR條件進行擴增，進行1ba基因轉錄水平的檢測，得到442bp的擴增條帶；

C、轉基因萊茵衣藻中Lba表達量的檢測：

取產氫培養的萊茵衣藻培養液，室溫3000rpm快速離心5min收集藻細胞，用250μl蛋白提取緩沖液懸浮，加入2μlβ-巰基乙醇，液氮凍融三次；在4℃條件下，14000g離心20min，取100μg的蛋白上清液加上0.25摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸配制的緩沖液(Tris-HCl)，pH?8.0；25％甘油；7.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)；0.25mg/ml溴酚蘭(bromophenolblue)；12.5％(v/v)β-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)于10％的分離膠和5％的濃縮膠進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜，抗大豆Lba多克隆抗體進性免疫雜交檢測，對辣根過氧化酶(Horseradish?Peroxidase，簡稱HRP)標記的抗體進行化學發光檢測；

(6)分析重組豆血紅蛋白球蛋白亞基Lba對萊茵衣藻生長的影響：

A、用TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計檢測萊茵衣藻在750nm處的吸光度；

B、取藻液3000rpm離心5min收集藻細胞，加入同體積的95％乙醇溶液，混合均勻，室溫避光放置20min，4℃下12000rpm離心10min；取上清，測定OD665及D649的吸光值；

C、計算葉綠素a，葉綠素b及總葉綠素的含量，單位mg/L：葉綠素Chl(mg/l)＝20.04(OD₆₄₉)+6.10(0D₆₆₅)；

(7)分析豆血紅蛋白球蛋白亞基Lba對萊茵衣藻產氫培養的耗氧量和產氫量的影響：

A、缺硫培養基中耗氧量和產氫量的檢測：

B、含硫培養基中對耗氧量和產氫量的檢測。