[發(fā)明專利]具有活性重組腫瘤特異性凋亡因子的制備方法及其制品的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010107675.8
• 申請日: 2010-02-10
• 公開（公告）號: CN101921820A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙洪禮
• 申請（專利權(quán)）人: 趙洪禮
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K1/107;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責(zé)任公司 21101
• 代理人: 王勇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物制藥的制備方法及應(yīng)用，尤其是具有活性的重組腫瘤特異性凋亡因子的制備方法、及該方法獲得的制品在抗腫瘤治療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

癌癥治療是世界性難題，癌癥的生物治療是手術(shù)、放療、化療等方法的重要補充，尋找更有效的生物制劑已成為21世紀(jì)重點研究領(lǐng)域之一。目前國內(nèi)外已上市的用于腫瘤治療的生物制劑主要有白細胞介素-2(IL-2)、干擾素(IFN)和單核細胞集落刺激因子(GSM)幾種，不僅可供臨床選擇的品種較少，而且均為免疫增強劑或調(diào)節(jié)劑，所以研發(fā)具有治療作用的新型生物制劑具有重要的社會意義和經(jīng)濟意義。

來源于雞貧血病毒的雞貧血病毒蛋白-3(vp3)對人的各種腫瘤細胞和異常轉(zhuǎn)化細胞具有特異性殺傷作用。由于vp3能夠選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細胞和轉(zhuǎn)化細胞的凋亡，而不誘導(dǎo)正常細胞的凋亡，被命名為腫瘤特異性凋亡因子(Apoptin)。研究結(jié)果表明，Apoptin誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡不依賴于抑癌基因-53(p53)作用途徑，也不被抑制細胞凋亡基因(Bcl-2)過量表達所抑制，因此有希望成為有效治療癌癥的新型生物制劑。

與現(xiàn)有的抗腫瘤藥物相比Apoptin具有如下特點：

(1)Apoptin誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡不依賴P53途徑，對那些P53基因突變的腫瘤細胞仍能誘導(dǎo)其凋亡，此點優(yōu)于那些依靠P53發(fā)揮作用的抗腫瘤藥，因為后者對P53突變的腫瘤細胞無效；

(2)Apoptin誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡不僅不受bcl-2過表達的抑制，反而bcl-2過表達能夠增強apoptin誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用，此點優(yōu)于那些被bcl-2過表達抑制的抗腫瘤藥；

(3)現(xiàn)有的抗腫瘤藥物盡管數(shù)量繁多，也不乏療效較好者，如紫杉醇、砷制劑等，但多數(shù)藥物毒副作用大，且反復(fù)用藥后多產(chǎn)生耐藥性，而使腫瘤復(fù)發(fā)，所以研制毒副作用小、療效顯著的抗腫瘤藥物是十分必要的。與紫杉醇相比，Apoptin具有獨特優(yōu)勢：①不受自然資源的限制，可根據(jù)市場需求無限量的生產(chǎn)；②抗腫瘤作用機理獨特，效果明顯，無或低毒副作用；③Apoptin誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是通過激活胱天蛋白酶、釋放細胞色素C和激活氨基末端激酶完成的，作用機理清楚。

但是由于Apoptin為來源于雞貧血病毒的蛋白質(zhì)，所以在Apoptin規(guī)模化生產(chǎn)和應(yīng)用中存在兩個重要的技術(shù)瓶頸，一是由于種屬間的差異，人體細胞膜表面沒有其相關(guān)的?蛋白受體，所以，Apoptin不能與人的細胞結(jié)合，進入細胞，引起細胞凋亡。而Apoptin誘導(dǎo)細胞凋亡的原理是進入細胞，激活與細胞凋亡相關(guān)的酶(主要為caspase)引起細胞凋亡。其二是原核表達的Apoptin在體外難溶解、不穩(wěn)定，很難獲得大量高純度的蛋白質(zhì)。所以盡管對Apoptin已經(jīng)研究了十余年，但上述兩個技術(shù)難題嚴重限制了Apoptin的產(chǎn)業(yè)化和臨床應(yīng)用，至今仍未應(yīng)用于臨床。所以解決這兩個技術(shù)難題是使Apoptin實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵，亦是國內(nèi)外的研究熱點。

針對這兩個難題，目前國內(nèi)外學(xué)者主要在以下兩個方面開展研究：①以病毒為載體，將Apoptin基因帶入腫瘤細胞，發(fā)揮Apoptin誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡作用。此種方法的優(yōu)點是方法比較簡單、易于操作、效果肯定；其缺點是不易產(chǎn)業(yè)化、病毒基因作為外源基因有潛在的引起基因重組發(fā)生突變的危險、病毒作為外援抗原反復(fù)應(yīng)用，會刺激機體產(chǎn)生抗體，減弱其作用。②采用顯微注射的方法將重組Apoptin蛋白直接注射到腫瘤細胞內(nèi)。此種方法因其技術(shù)要求和設(shè)備要求很高，只適合實驗室研究，不可能規(guī)模化應(yīng)用，所以不能產(chǎn)業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容

為能實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，本發(fā)明的目的在于提供一種在大腸桿菌中高效表達、穩(wěn)定好、純度高、且有高活性的重組腫瘤特異性凋亡因子的制備方法，及該方法獲得的制品在抗腫瘤治療中的應(yīng)用，以激活GST-Apopti誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的活性，使GST-Apoptin融合蛋白能夠與腫瘤細胞發(fā)生結(jié)合，用于誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，以達到能夠滿足臨床治療腫瘤的目的。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：在構(gòu)建谷胱肽轉(zhuǎn)移酶-腫瘤特異性凋亡因子(GST-Apoptin)融合蛋白原核表達載體(pGEX-A)的基礎(chǔ)上，建立一種純化GST-Apoptin融合蛋白的技術(shù)方法，使其在體外易溶解、穩(wěn)定、純度高；建立了GST-Apoptin融合蛋化學(xué)修飾方法，即用化學(xué)方法將葉酸連接到GST-Apoptin融合蛋白上，使GST-Apoptin融合蛋白能夠與腫瘤細胞發(fā)生結(jié)合，使其成為一種新型重組腫瘤特異性凋亡因子。

本發(fā)明提供的新型重組腫瘤特異性凋亡因子具有序列表中序列1所示的氨基酸序列；