[發明專利]具有活性重組腫瘤特異性凋亡因子的制備方法及其制品的應用

有效

• 申請號: 201010107675.8
• 申請日: 2010-02-10
• 公開（公告）號: CN101921820A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 趙洪禮
• 申請（專利權）人: 趙洪禮
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K1/107;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責任公司 21101
• 代理人: 王勇

1.一種制備具有活性的重組腫瘤特異性凋亡因子的方法，其特征是：

(1)通過人工合成的方法直接獲得Apoptin的基因片段，構建含GST-Apoptin基因的原核表達載體pGEX-A；

(2)GST-Apoptin融合蛋白的發酵、高效表達、溶解、復性及純化，具體是：將(1)表達GST-Apoptin融合蛋白的工程菌接種到含氨芐青霉素的液體肉湯培養基中，37℃搖床內培養，將菌液按比例轉種到含AP的LB培養基中擴增，37℃搖床內培養，菌液濃度達到光密為1.0時按比例接種到發酵罐內，待菌液濃度達到光密為2.0后，加入異丙基-β-D硫代半乳糖苷誘導劑；誘導培養4h，同時小量持續補加填料液，氨水自動調節pH7.0值，收集上述發酵液；離心收集菌體，高壓勻漿破碎菌體，離心收集沉淀，即為包涵體；取包涵體，加入包涵體溶解液磁力攪拌溶解4h；離心收集上清液；按比例緩慢加入復性液，室溫磁力攪拌溶解4h；4℃復性12h以上；超濾濃縮；將上述濃縮的復性液通過用平衡液平衡的瓊脂糖凝膠層析柱，收集目的峰；將目的峰再上用平衡液平衡好的去內毒素親和層析柱，收集洗脫峰即為純化的重組腫瘤特異性凋亡因子；

(3)GST-Apoptin融合蛋白的化學修飾，將上步驟后的GST-Apoptin與葉酸連接，使GST-Apoptin獲得活性，誘導腫瘤細胞凋亡作用。

2.一種權利要求1所述的制備具有活性的重組腫瘤特異性凋亡因子的方法獲得的制品，其特征是：它用于抗腫瘤治療。

3.按照權利要求1所述的制備具有活性的重組腫瘤特異性凋亡因子的方法，其特征是：所說的(2)GST-Apoptin融合蛋白的發酵、高效表達、溶解、復性及純化是：

(2.1)工程菌的活化、發酵及包涵體的回收，取-70℃保存的工程菌種接種到含AP的營養瓊脂平板培養基上，37℃培養12h以上；挑取單個菌落接種到含AP的LB液體培養基中，37℃搖床內培養12h以上，將菌液按1∶10比例接種到發酵罐內，37℃條件下培養；待菌液濃度達到2.0OD后，加入IPTG誘導劑；誘導培養4h，同時小量持續補加填料液，氨水自動調節pH7.0值。離心收集菌體，菌體用PB緩沖液懸浮，冰浴條件下，高壓勻漿破碎菌體，反復4次。離心破碎后的菌體，收集沉淀，即為包涵體；

(2.2)包涵體的溶解和復性稱取適量包涵體，加入包涵體溶解液，室溫條件下，磁力攪拌溶解4h；離心4℃，9000rpm，15min，收集上清液；按1∶8比例緩慢加入復性液，室溫磁力攪拌溶解4h；4℃復性12h以上；超濾濃縮20倍以上，立即純化或-20℃保存備用；

(2.3)腫瘤特異性凋亡因子純化用平衡液平衡Separose12層析柱；將上述濃縮的復性液按床體積的3％比例上樣，流速為2ml/min；分步收集第2個峰；SDS電泳鑒定后，取分子量為39kD純度高的蛋白質部分；將上述樣品再上用平衡液平衡好的FF層析柱或-20℃保存備用，按床體積75％比例上樣，樣品在柱內留置1h后，用平衡液洗脫；收集洗脫峰，-20℃保存待鑒定；

(2.4)純化的腫瘤特異性凋亡因子鑒定采用SDS電泳法或高效液相法測定蛋白質純度，純度在95％以上，采用紫外分光光度計測定蛋白質含量，大約在0.5mg/ml；采用鱟試劑法測定蛋白質樣品內的內毒素含量，1∶200合格；

上述各液體配方范圍及準備如下：

營養瓊脂培養基平皿是，按1.5％的濃度稱取營養瓊脂，加適量的注射用水，高壓滅菌，待培養基冷卻到45℃時，加入氨芐青霉素(AP)，終濃度為100μg/ml)，然后將瓊脂倒入平皿，待瓊脂凝固后，4℃保存備用，(可用1～2周)。

LB液體培養基是，以1000ml為單位按下列比例配制：溶解后高壓滅菌。

蛋白胨?????10g

酵母提取物?5g

NaCl???????1g

發酵液是，以20L為單位按下列比例配制，發酵罐內高壓滅菌。

蛋白胨??????????????????200g

酵母提取物??????????????100g

NaCl????????????????????20g

CaCl????????????????????2g

NH₄Cl???????????????????30g

葡萄糖??????????????????100g(單獨高壓，8磅)

磷酸二氫鈉.2H₂O?????????30g

磷酸氫二鈉.12H₂O????????120g

補料液是，以1000ml為單位按下列比例配制。

蛋白胨??????????????????100g

酵母提取物??????????????100g

葡萄糖??????????????????200g(700ml水溶解單獨高壓，8磅)

1mol?IPTG(1000倍)是，過濾除菌，-20℃保存。

IPTG????????????????????0.48g

水??????????????????????20ml

氨芐青霉素(AP，5000倍)，應用濃度為100μg/ml

AP??????????????????????500mg

水??????????????????????5ml

20mmol?PB緩沖液(pH7.2)以1000ml為單位按下列比例配制。

磷酸二氫鈉.2H₂O?????????3.12g

磷酸氫二鈉.12H₂O????????7.16g

EDTA????????????????????0.37g

20mmol?PB緩沖液(pH8.0)以1000ml為單位按下列比例配制。

磷酸二氫鈉.2H₂O?????????3.12g

磷酸氫二鈉.12H₂O????????7.16g

EDTA????????????????????0.37g

包涵體溶解液，以100ml為單位按下列比例配制。

20mmol?PB緩沖液(pH8.0)??100ml

肌酸鈉(1.0％-3.0％)?????1.0～3.0g

三乙醇胺(10-30mM)???????0.13～0.66ml

DTT(10-30mM)????????????0.15～0.45g

復性液，以1000ml為單位按下列比例配制。

20mmol?PB緩沖液(pH8.0)??1000ml

DTT(10-30mM)????????????1.5～4.5g

平衡液，以1000ml為單位按下列比例配制。

20mmol?PB緩沖液(pH7.2)??1000ml

肌酸鈉(0.1％-1.0％)?????0.1～1.0g

三乙醇胺(1mM)???????????0.132ml

包涵體洗滌液以1000ml為單位按下列比例配制。

20mmol?PB緩沖液(pH7.2)??1000ml

TritonX-100(0.1％)??????0.1ml

尿素(2mol)??????????????120g。