[發明專利]一種轉基因大豆檢測用質粒標準分子及其構建方法

無效

• 申請號: 201010106138.1
• 申請日: 2010-02-05
• 公開（公告）號: CN101775440A
• 公開（公告）日: 2010-07-14
• 發明（設計）人: 李飛武;張明;李蔥蔥;劉娜;邢珍娟;宋新元;邵改革;康嶺生;董立明;夏蔚;趙寧
• 申請（專利權）人: 吉林省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 余巖

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種轉基因生物及其產品檢測用質粒標準分子及構建方法，具體是一種適用于轉基因大豆MON89788定性和定量PCR檢測用質粒標準分子及其構建方法。

背景技術

自1996年以來，全球轉基因作物種植面積以年均10％以上的速率增長，2008年達到1.25億公頃。與轉基因作物產業化的蓬勃發展相對應的，是各國民眾對其安全性的擔憂。為保障消費者知情權和選擇權，許多國家和地區都制訂了轉基因生物標識管理制度，我國自2001年相繼頒布了一系列法律法規，對大豆、玉米等5類轉基因作物的17種產品實施強制性定性標識。

標識制度的實施依賴于轉基因產品檢測技術。目前主要有兩類技術：一類基于核酸方法，如PCR、基因芯片等，另一類基于蛋白質方法，如ELISA、試紙條等，其中PCR方法應用最廣。根據靶序列不同，PCR檢測策略分為4種，即篩查、基因特異性、構建特異性、轉化體特異性。轉化體特異性PCR方法以外源載體與受體植物基因組的連接區序列為檢測對象，具有品種特異性，已成為轉基因產品檢測方法的首選。

在應用PCR方法檢測轉基因產品時，需要設置陽性對照來對檢測活動進行監控，特別是在定量PCR檢測中需要用含量準確的轉基因生物陽性標準品來制作標準曲線。然而，由于專利權和現有技術的限制，轉基因生物陽性標準品很難獲得，這種現狀已成為檢測方法建立和應用的瓶頸。因此亟需研制能夠替代轉基因生物陽性標準品的新型陽性對照材料，以滿足不斷發展的轉基因檢測需求。

經過查閱文獻資料發現，質粒標準分子的概念及應用最早由日本學者Shindo等提出，相關內容發表在《Journal?of?AOACInternational》(國際官方農業化學家協會雜志)2002年第85卷第5期1119-1126頁，文中介紹了利用質粒標準分子替代轉基因生物陽性標準品用于轉基因作物及其產品檢測的方法。近年來，國內外眾多學者報道了一些用于轉基因產品檢測的質粒標準分子，例如：張大兵等人于2007年構建了適用于9種轉基因玉米檢測的質粒標準分子。然而，在對現有專利和文獻的分析中發現，還沒有任何轉基因大豆MON89788檢測用質粒標準分子構建的專利和文獻報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種轉基因大豆MON89788轉化體特異性檢測用質粒標準分子及其構建方法，以克服轉基因大豆MON89788轉化體特異性定性和定量PCR檢測中陽性標準品的匱乏，滿足轉基因大豆MON89788轉化體特異性檢測需求。

為實現上述目的，本發明提供一種轉基因大豆檢測用質粒標準分子，其特征在于：通過特異性PCR引物，從轉基因大豆MON89788基因組DNA中擴增出大豆內標準基因lectin特異性序列、MON89788大豆3′端轉化體特異性序列和5′端轉化體特異性序列，利用酶切、連接、轉化分子克隆技術將這3個片段依次構建到質粒載體pMD18-T中，獲得質粒標準分子pMD-LM3M5。

一種轉基因大豆檢測用質粒標準分子的構建方法，包括以下步驟：

(1)利用GenBank數據庫和相關文獻檢索，獲得大豆內標準基因lectin、轉基因大豆MON89788?3′端和5′端轉化體特異性序列。

所述的大豆內標準基因lectin，是指大豆凝集素基因，在大豆基因組中高度保守，具有種間特異性、種內非特異性和單拷貝數等特點。

所述的轉基因大豆MON89788?3′端轉化特異性序列，是指轉基因大豆MON89788外源載體3′端與大豆基因組連接區的DNA序列。

所述的轉基因大豆MON89788?5′端轉化特異性序列，是指轉基因大豆MON89788外源載體5′端與大豆基因組連接區的DNA序列。

(2)根據lectin基因序列、MON89788大豆的3′端和5′端轉化體特異性序列，設計定性PCR引物，對轉基因大豆MON89788陽性標準品的基因組DNA進行PCR擴增。

所述的定性PCR引物，是指長度為25±8nt的寡核苷酸鏈，與lectin基因或MON89788大豆的3′端或5′端轉化體特異性序列完全相同或者互補。

所述的轉基因大豆MON89788陽性標準品，是指轉基因含量為100％的轉基因大豆MON89788籽粒。

(3)分別回收lectin基因以及MON89788大豆3′端和5′端轉化體特異性序列的定性PCR產物。將lectin基因PCR回收產物構建到質粒載體pMD18-T上獲得中間質粒分子pMD-L。