[發明專利]魚類哈維氏弧菌PCR快速檢測試劑盒及使用方法

無效

• 申請號: 201010106108.0
• 申請日: 2010-02-02
• 公開（公告）號: CN101838691A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發明（設計）人: 陳吉祥;劉瑞;徐廣峰
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南

技術領域

本發明屬于水產動物、海產品及海水污染的監測技術。特別是水產養殖動物的哈維氏弧菌感染的檢測--魚類哈維氏弧菌PCR快速檢測試劑盒及使用方法。

背景技術

哈維氏弧菌廣泛存在于海洋環境中，是引起水產動物感染致病的主要菌源，能引起水產動物的皮膚潰爛、肌體出血和大批死亡，危害十分巨大。已有的研究表明，哈維氏弧菌攜帶的溶血素是水產動物的致病因子即感染致病的根源，對于哈維氏弧菌的檢測方法，目前主要有生理生化檢測方法、熒光抗體技術、酶聯免疫吸附試驗、rRNA基因探針雜交技術等。但這些方法存在一些缺點和不足：生理生化檢測十分耗時耗力、結果不穩定；熒光抗體技術需要較昂貴的儀器設備；酶聯免疫吸附實驗靈敏度不高，且易受干擾、rRNA基因在物種中非常保守，使得技術特異性不強。目前的PCR雖然是一種具有靈敏度高、特異性強的靶DNA快速檢測方法，樣品中含有少量的致病因子就能檢出。然而，已有的PCR檢測技術方法較為繁瑣，且對哈維氏弧菌檢測識別率較低。

發明內容

本發明的目的是提供一種魚類哈維氏弧菌的PCR快速檢測試劑盒及使用方法，以快速檢測和判定或者監測水產動物、海產品及哈維氏弧菌污染的海水，彌補現有技術的不足。

研究表明：哈維氏弧菌攜帶的溶血素是水產動物感染致病的根源，即本發明所指的致病因子，快速檢測樣品中的致病因子基因即可判斷水產動物是否感染致病，從而為進一步為防治感染提供依據。本發明在克隆出哈維氏弧菌致病因子的編碼基因，分析其序列特征的基礎上，以該特異基因的保守區段設計特異性引物，并且采用PCR快速技術檢測哈維氏弧菌，具有準確、快速、靈敏等優點。可作為水產養殖魚類疾病的快速、簡便、準確的檢測方法，也可用作養殖水體、飼料和海產品的質量檢測以及海水污染的監控。

本發明的主要原理為：裂解液將樣品中的細菌進行裂解，釋放出細菌DNA，加入PCR反應試劑和Tag酶等，以哈維氏弧菌致病因子的特異DNA片段引物為模板，對樣品中釋放出的哈維氏弧菌致病因子DNA進行專一性擴增，濃度達到可檢測范圍后進行檢測。由于設計的特異引物為哈維氏弧菌所特有，因此，樣品中含有的哈維氏弧菌就被會被檢出。

本發明的PCR快速檢測試劑盒包括以下7種試劑：

(1)裂解液：含有胰蛋白酶、Tris、EDTA，pH為7.5-8.5，其濃度分別為1-10mg/mL，10-50mmol/L，1-10mmol/L；

(2)PCR反應液：含dNTP和MgCL₂溶液

dATP，dTTP，dCTP和dGTP的四種混合物dNTP，其中每種濃度2.0-3.0mmol/L；濃度為20-30mmol/L的MgCL₂溶液；

(3)Taq酶液：3U/μL；

(4)引物對：

所述的引物對是人工設計并人工合成的DNA片段，堿基序列分別為：

上游引物：5’-GAAAACCAATACATCGCTCTGACT-3’，10-20μmol/L

下游引物：5’-TTGACAATTGATTCGTACTTTCTAGC-3’，10-20μmol/L

(5)滅菌去離子水

(6)陽性對照

(7)陰性對照。

本發明使用PCR快速檢測試劑盒檢測哈維氏弧菌的方法，其特征在于檢測程序如下：

a.待檢樣品的處理及模板DNA制備

待檢樣品經無菌生理鹽水清洗后，取0.1-0.2g待檢組織于潔凈的滅菌勻漿器中，加入0.5-1.0mLTE緩沖液，充分研磨，取0.5-1.0mL樣品液于1.5mL滅菌離心管，用于提取模板DNA。

將上述模板DNA于100℃水浴保持10-15分鐘。冷卻后于4℃12000rpm離心10分鐘，吸取上清200μL作為PCR模板，并于-20℃保存。

海水樣品不需要樣品處理，可直接進入PCR擴增。

b.PCR擴增

在一個PCR管內加入1μL模板DNA，9μLPCR反應液，1μL酶液，1μL引物，用滅菌去離子水補足到50μL，在3000g離心5秒鐘混勻，置于PCR儀中進行擴增使擴增倍數達到10⁷左右。同樣制作其它待測樣品以及陽性對照和陰性對照品。

PCR擴增條件：94℃預變性3分鐘，94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，如此進行25個循環，然后72℃延伸10分鐘。

本發明的PCR快速檢測結果判定方法：