[發(fā)明專利]魚類哈維氏弧菌PCR快速檢測試劑盒及使用方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010106108.0
• 申請日: 2010-02-02
• 公開（公告）號: CN101838691A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳吉祥;劉瑞;徐廣峰
• 申請（專利權(quán)）人: 中國海洋大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 張中南

1.一種魚類哈維氏弧菌PCR快速檢測試劑盒，其特征在于包括以下7種試劑：

(1)裂解液：含有胰蛋白酶、Tris、EDTA，pH為7.5-8.5，其濃度分別為1-10mg/mL，10-50mmol/L，1-10mmol/L；

(2)PCR反應(yīng)液：含dNTP和MgCL₂溶液；

dATP，dTTP，dCTP和dGTP的四種混合物dNTP，其中每種濃度2.0-3.0mmol/L；濃度為20-30mmol/L的MgCL₂溶液；

(3)Taq酶液：3U/μL.；

(4)引物對：

上游引物：5’-GAAAACCAATACATCGCTCTGACT-3’，10-20μmol/L

下游引物：5’-TTGACAATTGATTCGTACTTTCTAGC-3’，10-20μmol/L

(5)滅菌去離子水

(6)陽性對照

(7)陰性對照。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚類哈維氏弧菌PCR快速檢測試劑盒，其特征在于所述PCR試劑的最佳成分為：

PCR反應(yīng)試劑最佳用量：

??試劑盒試劑組成(25個反應(yīng))??體積??(1)裂解液??20mL(25x800μL)??(2)PCR反應(yīng)液??225μL(25x9μL)??(3)Taq酶液??25μL??(4)PCR引物??25(25x1μL)??(5)滅菌去離子水??1000μL??(6)陽性對照??25μL??(7)陰性對照??25μL

3.利用上述魚類哈維氏弧菌PCR快速檢測試劑盒檢測哈維氏弧菌的方法，其特征在于檢測程序如下：

a.待檢樣品的處理及模板DNA制備

待檢樣品經(jīng)無菌生理鹽水清洗后，取0.1-0.2g待檢組織于潔凈的滅菌勻漿器中，加入0.5-1.0mL?TE緩沖液，充分研磨，取0.5-1.0mL樣品液于1.5mL滅菌離心管，用于提取模板DNA；

將上述模板DNA于100℃水浴保持10-15分鐘，冷卻后于4℃12000rpm離心10分鐘，吸取上清200μL作為PCR模板，并于-20℃保存；

海水樣品不需要樣品處理，可直接進入PCR擴增；

b.PCR擴增

在一個PCR管內(nèi)分別加入1μL模板DNA，9μLPCR反應(yīng)液，1μL酶液和1μL引物，然后用滅菌去離子水補足到50μL，在3000g離心5秒鐘混勻，置于PCR儀中進行擴增使擴增倍數(shù)達到10⁷左右；同樣制作其它待測樣品以及陽性對照和陰性對照品；

PCR擴增條件：94℃預(yù)變性3分鐘，并且分別以94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘和72℃延伸1分鐘，如此進行25個循環(huán)，然后72℃延伸10分鐘。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚類哈維氏弧菌PCR快速檢測試劑盒，其特征在于PCR快速檢測結(jié)果判定方法：

取已加入0.25-0.75％澳酚藍上樣緩沖液的10μL?PCR產(chǎn)物，加于含有溴化乙錠濃度為0.5-1.0μg/mL的1.2-2.0％瓊脂糖凝膠中，在100-150v電壓下電泳25-30分鐘，取電泳結(jié)束后的凝膠在紫外透射儀下觀察，當在622bp出現(xiàn)特異核酸條帶，即可判斷樣品中含有哈維氏弧菌，反之則沒有。