[發明專利]一種標記細胞骨架蛋白的多肽及其真核表達載體

無效

• 申請號: 201010106085.3
• 申請日: 2010-01-19
• 公開（公告）號: CN101880321A
• 公開（公告）日: 2010-11-10
• 發明（設計）人: 張斌;王濤;藥立波
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/13;C12N15/62;C12N15/79;G01N21/64
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及細胞骨架蛋白的標記，特別涉及一種標記細胞骨架蛋白的多肽及真核表達載體。

背景技術

運動是生命體最顯著的特征之一。作為生命體組成單位的細胞，其多種多樣的生理活動都與細胞的運動密切相關，比如細胞形態的改變與維持、細胞內物質運輸、細胞分裂、胞吞與胞吐等。而存在于細胞(特別是真核細胞)中的細胞骨架系統，不僅是支撐活細胞的結構，決定細胞的形狀，賦予其強度，而且是細胞內各種細胞器空間排列的物質基礎。細胞骨架包括三種類型的蛋白質纖維，即微絲(microfilament)、微管(Microtubule)和中間纖維(intermediate?filaments，IF)。

微絲是由肌動蛋白(actin)組成的直徑約為7nm的纖維結構。肌動蛋白又被稱為G-Actin，全稱為球狀肌動蛋白(Globular?Actin)，簡稱G肌動蛋白。肌動蛋白單體為球形，其表面上有一ATP結合位點。肌動蛋白單體一個接一個連成一串肌動蛋白鏈，兩串這樣的肌動蛋白鏈互相纏繞扭曲成一股微絲；這種肌動蛋白多聚體又被稱為纖維形肌動蛋白(F-Actin，Fibrous?Actin)。微絲能被組裝和去組裝：當單體上結合的是ATP時，就會有較高的相互親和力，單體趨向于聚合成多聚體，就是組裝；而當ATP水解成ADP后，單體親和力就會下降，多聚體趨向解聚，于是去組裝。

細胞內肌動蛋白的這種組裝-去組裝動態變化參與了細胞許多重要的生理過程，比如細胞運動時偽足的生成、發育時期干細胞的遷移、神經元細胞生長錐的生長、細胞與細胞外基質的相互作用以及腫瘤細胞的轉移等。

鬼筆環肽(phalloidin)是從毒蕈類鬼筆鵝膏(Amanita?phalloides)中得到的有毒的環狀七肽，它同細胞松弛素B的作用相反，只與聚合的微絲(F-Actin)結合，而不與肌動蛋白單體分子結合。它同聚合的微絲結合后，抑制了微絲的解體，因而破壞了微絲的聚合和解聚的動態平衡。

鬼筆環肽可以與聚合的微絲結合的特殊性質使得它具有一個重要的用途：通過讓這種毒素與熒光物質結合，然后FITC和Rhodamin等熒光物質標記的鬼筆環肽再特異的與真核細胞的F-actin結合，從而顯示微絲骨架在細胞中的分布，研究細胞內部的工作機制。生產這種熒光標記的鬼筆環肽的公司包括Invitrogen和Sigma公司，但是售價不菲。

發明內容

本發明解決的問題在于提供一種相對廉價的、實時的標記細胞骨架蛋白F-actin的多肽及真核表達載體，該多肽轉入細胞或者通過真核表達載體在細胞得到表達后可以與微絲結合，結合熒光標記的多肽能夠用于細胞骨架蛋白的標記。

本發明是通過以下技術方案來實現：

一種標記細胞骨架蛋白的多肽，該多肽為JN27，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述的多肽是在JN27的C端增加3個氨基酸殘基得到的多肽JN30，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

所述的多肽是在JN27的N端增加11個氨基酸殘基的穿膜肽得到的多肽TatJN27，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

一種用于細胞骨架蛋白標記的真核表達載體，該載體包含標記基因EGFP和細胞骨架蛋白靶向基因的融合基因，所述的細胞骨架蛋白靶向基因為基因JN27或JN30；基因JN27的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，基因JN30的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。

所述的真核表達載體是pEGFP-C2-JN27，通過HindIII和BamHI酶切位點將基因JN27克隆到pEGFP-C2載體上。

所述的真核表達載體是pEGFP-C2-JN30，通過HindIII和BamHI酶切位點將基因JN30克隆到pEGFP-C2載體上。

多肽JN27、JN30或TatJN27應用于細胞骨架蛋白的標記。

所述的應用于細胞骨架蛋白的標記是將多肽JN27或JN30用熒光物質標記后，再將熒光標記的JN27或JN30加入到抗體封閉液中，與經過固定、Triton處理的待標記細胞孵育2h，然后在熒光顯微鏡下顯示標記結果；

或者將多肽TatJN27用熒光物質標記后，再將熒光標記的TatJN27直接加入待標記細胞的培養液中，37℃孵育12h；然后在熒光顯微鏡下顯示標記結果。

真核表達載體pEGFP-C2-JN27或pEGFP-C2-JN30應用于細胞骨架蛋白的標記。