[發明專利]云斑尖塘鱧微衛星標記的高效篩選方法及應用

無效

• 申請號: 201010105180.1
• 申請日: 2010-01-22
• 公開（公告）號: CN102134586A
• 公開（公告）日: 2011-07-27
• 發明（設計）人: 尹紹武;駱劍;齊興柱;彭艷輝;朱曉平
• 申請（專利權）人: 海南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于魚類分子遺傳學DNA標記技術領域，具體涉及云斑尖塘鱧(Oxyeleotrismarmoratus)微衛星位點(SSR)的快速高效篩選及應用。

背景技術

云斑尖塘鱧俗名筍殼魚(Marble?goby)，屬鱸形目(Pereifomes)、塘鱧科(Eleotridae)、尖塘鱧屬(Oxyeleotris)。云斑尖塘鱧是原產于泰國、老撾等東南亞國家的大型塘鱧科名貴魚類，在我國沿海城市及港、澳、臺很受消費者歡迎，具有很高的經濟價值。自我國從東南亞引種后，現已成為我國南方沿海地區的重要淡水養殖對象。

由于人工繁育過程中存在的小群體繁育、近交和非隨機交配因素，可能產生遺傳變異水平降低、性狀退化和抗逆性能降低等問題。選育經濟性狀優良的云斑尖塘鱧是保障其產業快速穩定發展的重要方法。因此，對云斑尖塘鱧開展遺傳結構的研究可為分析其群體遺傳多樣性、繁殖親本的選育、引種群體的選擇及養殖群體的遺傳變異監測等提供有效的分析手段。目前，分子標記技術已成為開展魚類遺傳多樣性研究的重要方法之一，利用與優良性狀相關的分子標記進行遺傳選育工作可望獲得生長性能突出、抗逆性強的親本群體。微衛星(Miciosatellite)又稱SSR(簡單重復序列)，是指基因組中由2-6個堿基組成的基本序列串聯重復組成的短片段，如(CA)n、(GA)n、(GAA)n等。在真核生物基因組中分布廣泛，并具有多態性高、孟德爾方式遺傳、共顯性、數目多、易于檢測等優點。SSR標記技術已被廣泛用于水產生物遺傳連鎖圖譜構建、比較基因組研究、遺傳多樣性分析和系統學研究等。由于SSR位點具有物種特異性，迫切需要開發大量的微衛星標記供水產生物遺傳育種分析及商業用途。

傳統的微衛星標記的開發主要通過數據庫篩選法；直接篩選法(PCR法)和文庫富集法三種。數據庫篩選法需要大量的已有DNA序列信息作為搜索對象，基礎研究較少的物種，特別是在多數水產動物上局限性很大；直接篩選法技術難度較低，但需要的工作量較大，效率很低；而文庫富集磁珠法由于對基因組文庫進行了富集，顯著提高了微衛星位點的篩選比例，也大大降低了測序的費用。然而，傳統的文庫富集法也存在著一些問題：1.為了抵消富集步驟和轉化步驟產生的DNA片段的損失，一般通過增加兩個25-35個循環的PCR步驟大量增加文庫片段，這樣會導致某一些DNA片段的數量大幅增加成為優勢片段，從而出現相同的菌落克隆，最終每次篩選到的微衛星位點數目仍然比較有限；2.盡管篩選微衛星的比例較直接篩選法要高，但是最終的測序結果顯示仍然只有30％-40％的富集片段含有微衛星位點；3.采用同位素探針雜交的方法可以鑒別菌落中是否包含有微衛星位點，提高篩選的效率，但是此方法步驟繁雜，且一般實驗室沒有條件開展同位素工作，從而限制了應用范圍。

發明內容

本發明提供一種云斑尖塘鱧微衛星標記的高效篩選方法?？煽焖匍_發微衛星標記為云斑尖塘鱧的種質資源保護、種質改良及遺傳育種等方面提供科學依據和檢測手段。

本發明的目的在于改進現有的磁珠富集法，高效快速地篩選微衛星位點；減少測序成本；同時克服采用同位素進行二次篩選在安全上的不足。

本發明的基本原理是(1)設計合適的粘末端限制性內切酶酶切體系及對應的粘末端接頭；(2)利用生物素與鏈霉素產生免疫反應的性質，富集含有微衛星位點的DNA片段；(3)建立富集片段的克隆文庫，并通過二次篩選含有微衛星位點的克隆；(4)對得到的陽性克隆進行DNA測序，并從中篩選合適的微衛星位點設計引物；(5)檢測微衛星位點的多態性。

本發明的目的是按照以下步驟實現的：1.基因組DNA的提??；2.酶切、連接及Pre-PCR；3.生物素標記的寡核苷酸探針與DNA文庫雜交，并通過鏈霉素磁珠富集及Post-PCR；4.建立富集片段的T-克隆文庫，對陽性克隆的二次篩選及測序；5.根據獲得的微衛星序列設計引物及微衛星位點多態性分析。

所述步驟1，基因組DNA的提取包括：剪取實驗魚的尾鰭0.1～0.2g，采取常規酚-氯法提取基因組DNA；核酸蛋白測定儀測定其純度及濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。