[發(fā)明專利]云斑尖塘鱧微衛(wèi)星標(biāo)記的高效篩選方法及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010105180.1
• 申請日: 2010-01-22
• 公開（公告）號: CN102134586A
• 公開（公告）日: 2011-07-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 尹紹武;駱劍;齊興柱;彭艷輝;朱曉平
• 申請（專利權(quán)）人: 海南大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種云斑尖塘鱧微衛(wèi)星標(biāo)記的高效篩選方法，依次包括下列程序：(1)基因組DNA的提取；(2)酶切、連接及Pre-PCR；(3)生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針與DNA文庫雜交，并通過鏈霉素磁珠富集及Post-PCR；(4)建立富集片段的T-克隆文庫，對陽性克隆的二次篩選及測序；(5)根據(jù)獲得的微衛(wèi)星序列設(shè)計引物及微衛(wèi)星位點多態(tài)性分析。

2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種云斑尖塘鱧微衛(wèi)星標(biāo)記的高效篩選方法，其特征是步驟(2)酶切、連接及Pre-PCR包括：①選擇合適的粘末端限制性內(nèi)切酶及大量的基因組DNA，使得DNA酶切片段主要分布在400-1200bp的范圍內(nèi)，本發(fā)明應(yīng)用實例采用的Bsp143I，反應(yīng)體系為：基因組DNA?8μg，10×buffer?4μL，內(nèi)切酶5U，總體積40μL；②連接所用接頭LinkerA由兩條寡核苷酸鏈溶液混合后94℃水浴10min，之后2-3小時緩慢降溫到室溫合成；LinkerA的長鏈5’端帶有磷酸基團，連接反應(yīng)時可與所結(jié)合DNA片段的3’端形成磷酸二酯鍵；③Pre-PCR一共作10管：每個反應(yīng)管中加入10×Taq?buffer?2μL，dNTP(2mM)1μL，MgCl₂(25mM)1.5μL，引物Primer?I(10μM)1μL，Taq酶1U，模板DNA?3.5μL，總體積為20μL；Primer?I為Linker?I中的寡核苷酸短鏈；PCR反應(yīng)為12個循環(huán)；PCR反應(yīng)液經(jīng)AxyPrep?DNA試劑盒回收。

3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種云斑尖塘鱧微衛(wèi)星標(biāo)記的高效篩選方法，其特征是步驟(3)生物素探針與文庫雜交，鏈霉素磁珠富集及Post-PCR，包括：①取全量40μL的DNA洗脫液，加ddH₂O?460μL，將反應(yīng)管置于95℃水浴變性5分鐘；同時將50μM的生物素探針Biotin(CA)和Biotin(GA)各3μL加入另一EP管中，并加入20×SSC?13μL，68℃預(yù)熱，加入完成變性步驟的DNA溶液并繼續(xù)68℃保溫雜交10分鐘，之后放置室溫冷卻；②使用洗滌過的SA-PMPs磁珠富集文庫片段；加入100μL?ddH₂O，重懸磁珠，95℃水浴5min，利用磁架收集磁珠，將DNA從磁珠上洗脫下來；利用真空干燥儀或烘箱將100μL?DNA液濃縮至20μL；③Post-PCR一共作5管，每個反應(yīng)管中加入10×Taq?buffer?2μL，dNTP(2mM)1μL，MgCl₂(25mM)1.5μL，引物Primer?I(10μM)1μL，Taq酶1U，模板DNA?4μL，總體積為20μL；PCR反應(yīng)為12個循環(huán)，PCR反應(yīng)液經(jīng)AxyPrep?DNA試劑盒回收。

4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種云斑尖塘鱧微衛(wèi)星標(biāo)記的高效篩選方法，其特征是步驟(4)構(gòu)建富集片段的T-克隆文庫，對陽性克隆的二次篩選及測序，包括：①使用M13和RV-M引物篩選插入片段在400-1200bp范圍內(nèi)的陽性克隆；②二次篩選采用M13、RV-M引物中的一條與PrimerII-CA或PrimerII-GA組成一對引物，一共四個組合：M13+PrimerII-CA，RV-M+PrimerII-CA，M13+PrimerII-GA，RV-M+PrimerII-GA；選取在任一PCR反應(yīng)出現(xiàn)擴增片段的細菌克隆送生物公司測序。所述引物序列，

PrimerII-CA????5’-CACACACACACACACACACACACA-3’

PrimerII-GA????5’-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA-3’。