[發(fā)明專利]基于酶與蛋白質(zhì)交聯(lián)的檢測空氣或水體中微生物含量的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010104924.8
• 申請日: 2010-01-29
• 公開（公告）號: CN101818190A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邢怡銘;郭永超;鐘明;黃英敏;羅國湧
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州市香港科大霍英東研究院;利民(番禺南沙)電器發(fā)展有限公司
• 主分類號: C12Q1/28
• 分類號: C12Q1/28;C12Q1/06;G01N21/33
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 周克佑

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明描述了一種基于酶與蛋白質(zhì)交聯(lián)、用于檢測空氣或水體中的微生物含量的檢測方法。

背景技術(shù)

空氣、水是維持人類生命不可或缺的物質(zhì)，它們直接進入人體或與人接觸。如果空氣、水帶有大量的病原微生物，將嚴重威脅人類的健康。因此通過檢測空氣和水中微生物的含量，對環(huán)境質(zhì)量進行監(jiān)控顯得極為重要。空氣中的微生物主要為細菌和真菌，病毒含量較少；由于空氣中營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、水分不充足、溫差大，且有較強的紫外線輻射，細菌和真菌在短時間內(nèi)就會死亡，抵抗力較強的微生物則可以存活幾天、幾周甚至數(shù)月，總體含量通常為2500～5000cfu/m³，但不同的時空其微生物含量分布相差極大。水體中由于各水域中營養(yǎng)物質(zhì)的組成、濃度、水溫、溶解氧的差異及微生物的來源不同等原因，微生物的種類、數(shù)量相差也很大。

目前檢測空氣和水體中微生物含量的方法主要有：一、微菌落計數(shù)：沉降計數(shù)法、濾膜法、撞擊平皿法和吸收管法，具體是將一定量的樣品(或樣品稀釋液)經(jīng)膜過濾、撞擊平皿法或吸收管法將微生物收集，再將收集到的微生物放在培養(yǎng)基上或放在浸行液體培養(yǎng)基的厚紙板上，在適宜溫度條件下培養(yǎng)一段時間后計算菌落數(shù)，此法是最早期的用于微生物計數(shù)的方法，因其檢測結(jié)果準確可靠，至今仍是較為普遍的微生物檢測方法之一，但微菌落計數(shù)要求無菌操作，且因擴增培養(yǎng)時間長導致檢測時間較長，至少需要10小時以上才能出檢測結(jié)果；二、阻抗測定法，這種方法依據(jù)的原理是：微生物在培養(yǎng)基中不斷增殖的過程中，其代謝產(chǎn)物的增加會導致液體培養(yǎng)基中電阻的變化，使介質(zhì)的導電性增強，即電阻減小，只有當微生物數(shù)目達到10⁶-10⁷個/毫升時，這種電阻的變化才能被記錄到，電阻或?qū)щ娦宰兓_到可檢測的時刻，稱為檢出時間，此法難以測量電導變化的微生物，且檢測儀器費用較高；三、ATP生物發(fā)光法，應(yīng)用熒光素-熒光素酶制劑進行的，在活細胞中ATP含量近乎是恒定的，利用特殊的酶試劑水解掉細菌膜，使ATP釋放，ATP與熒光素-熒光素酶制劑反應(yīng)變成AMP和光，產(chǎn)生的光強度與ATP成正比，通過測定光強度可確定細菌濃度，此檢測法快速，僅需十幾秒便可出檢測結(jié)果，但檢測成本高，且易受干擾物的影響；四、過氧化物酶生物檢測法，它是根據(jù)微生物會在新陳代謝時產(chǎn)生一種過氧化物酶，而過氧化物酶的產(chǎn)生與生物活性的高低成一定比例。所以樣品中現(xiàn)存的酶的數(shù)量可以反應(yīng)當前總的生物活性。通過檢測反應(yīng)物與酶反應(yīng)釋放氧氣，并轉(zhuǎn)換成數(shù)量讀出(BMR)，此檢測法快速靈敏，但僅局限于對好氧微生物的檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的，就是提供一種操作簡便、分析快速準確、靈敏度高成本較低、具備現(xiàn)場可操作性、基于酶與蛋白質(zhì)交聯(lián)的檢測空氣和水體中微生物含量的方法。

本發(fā)明先在待測樣品溶液中(若檢測空氣微生物則先將空氣中的微生物收集于水相)加入酶和交聯(lián)劑，通過交聯(lián)劑將酶和微生物的表面蛋白質(zhì)交聯(lián)，膜過濾收集酶-微生物交聯(lián)結(jié)合物，加入特異性底物進行顏色反應(yīng)或是電化學反應(yīng)，最后通過合適的方法檢測信號，其檢測值的大小與樣品中微生物的含量直接對應(yīng)，從而實現(xiàn)對微生物含量的快速檢測。由于酶的催化效率極高，可以極大地放大反應(yīng)效果，使測定方法達到很高的靈敏度，酶促反應(yīng)的過程如下：

無色的還原型染料-供氫體(DH2)，在結(jié)合在微生物表面蛋白上的酶的催化作用下，可生成有色的產(chǎn)物-氧化型染料(D)。

本發(fā)明的基于酶與蛋白質(zhì)交聯(lián)的微生物定量檢測方法，具體有如下步驟：

一、交聯(lián)：分別將酶和交聯(lián)劑加入待測樣品中，室溫20-25℃靜置交聯(lián)；

若是檢測空氣微生物，所述的待測樣品則為：使用現(xiàn)有技術(shù)將空氣中的微生物收集于水相；

所述的加入的酶分子數(shù)與樣品中微生物數(shù)之比大于16∶1；

所述的交聯(lián)劑加入的量依交聯(lián)劑種類和交聯(lián)方式按現(xiàn)有技術(shù)規(guī)范確定；

所述的靜置時間依交聯(lián)劑的選擇和交聯(lián)方式按現(xiàn)有技術(shù)規(guī)范確定；

二、分離：采用0.22μm孔徑微孔膜過濾法收集交聯(lián)微生物，用洗膜緩沖液沖洗去除未交聯(lián)的酶液；

三、檢測信號：加入特異性底物顯色液，顯色或產(chǎn)生電化學信號；

四、檢測：顯色1分鐘后加入終止液，之后用紫外分光光度計檢測450nm吸光度(OD450)，與不含有微生物的對照樣品比較，得出微生物濃度。

所述的試劑及待測樣品均需平衡至室溫20-25℃。

所述的酶為辣根過氧化物酶。

所述的交聯(lián)劑為：1％戊二醛，或是4mg/ml的碳化二亞胺加6mg/ml的N-羥基琥珀酰亞胺。