[發明專利]在大腸桿菌中高效表達可溶性細菌漆酶的方法

有效

• 申請號: 201010103875.6
• 申請日: 2010-02-02
• 公開（公告）號: CN101736026A
• 公開（公告）日: 2010-06-16
• 發明（設計）人: 王行國;李洋;龔子君;左文峰
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N9/02;C12R1/19;C12R1/22;C12R1/01
• 代理公司: 武漢金堂專利事務所 42212
• 代理人: 丁齊旭

技術領域

本發明涉及的是生物工程技術，特別是在大腸桿菌中高效表達可溶性細菌 漆酶的方法。

背景技術

由于漆酶能夠氧化芳香類化合物和其它一些非芳香類有機物，具有廣泛的底 物特異性，因此在紙漿漂白、紡織品染料脫色、有毒廢棄物的去除、生物修復、 醫療診斷或作偽抗癌藥物制備的催化劑以及生物傳感器等方面具有巨大的應用 潛力。但是缺少大量廉價酶源的供應阻礙了漆酶商業化的應用。解決這個問題 的一個主要方法是通過漆酶的異源表達來獲得大量的漆酶。由于需要糖基化修 飾才具有活性，真菌漆酶不適合在原核生物表達系統中表達，目前主要在酵母 和絲狀真菌表達系統中表達，其活性酶表達量仍然較低，需要進一步提高才能 滿足工業上的需要。細菌漆酶具有與真菌漆酶相似的生物學功能，不需要糖基 化修飾，能在原核生物細菌表達系統中實現高效表達。但由于高效表達的酶蛋 白絕大部分在細菌胞內形成不溶且無活性的包涵體，有活性的可溶性酶蛋白通 常不到10％。較低比例的可溶性酶蛋白嚴重影響了細菌漆酶的開發與應用。

介于上述現狀，本研究發明提出利用融合酶的技術思路，在低溫條件下進 行表達，提高大腸桿菌胞內可溶性細菌漆酶的含量，實現功能性細菌漆酶的高 效表達。

發明內容

本發明提出了一種在大腸桿菌中高效表達可溶性細菌漆酶的方法。利用麥 芽糖結合蛋白與細菌漆酶融合形成麥芽糖結合蛋白-細菌漆酶融合蛋白并在18 -23C°低溫下表達的技術思路，在大腸桿菌細胞內實現了高效表達麥芽糖結合 蛋白-細菌漆酶融合蛋白，克服了細菌漆酶高效表達時形成大量的不溶性包涵 體的問題。麥芽糖結合蛋白與細菌漆酶融合后不影響細菌漆酶的酶活性，可直 接利用融合蛋白進行漆酶催化反應，不需要先切除融合蛋白中的麥芽糖結合蛋 白后再分離純化出細菌漆酶的操作步驟。

本發明是這樣實現的。具體操作步驟為：

A、麥芽糖結合蛋白-細菌漆酶基因的構建：

(1)在50μl的體系中，加入5μl?10×限制性內切酶反應緩沖液，并按1μg DNA∶3-5U限制性內切酶的比例加入DNA和限制性內切酶，混勻后37℃保溫 2-12小時。使用該方法分別用相同的限制性內切酶消化切割pMAL-c2x質粒DNA 和細菌漆酶基因DNA；

(2)用1％瓊脂糖凝膠電泳分離限制性內切酶消化樣品，在紫外燈下用刀片 切出目的DNA片段，然后按DNA片段回收試劑盒的方法回收目的DNA片段；

(3)在25μl的體系中，加入2.5μl?10×T₄DNA連接酶反應緩沖液，并按1∶5 的比例加入限制性內切酶消化過的pMAL-c2x質粒DNA和細菌漆酶基因DNA，再 加入1μlT₄DNA連接酶。16℃水浴4-12小時將細菌漆酶基因插入pMAL-c2x質 粒上的多克隆位點，使細菌漆酶基因連接在pMAL-c2x質粒上攜帶的麥芽糖結合 蛋白基因malE的后面，形成一個重組表達質粒。

B、陽性轉化子的篩選：利用常規的CaCl₂法制備E.coli?DH10B感受態細 胞，然后將5-10μl連接反應混合物與100μl?E.coli?DH10B感受態細胞混合， 冰浴30分鐘。42℃熱休克1.5分鐘后立即置冰上5分鐘。加入900μl新鮮LB 培養基(蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl10g、加水至1L(pH7.0))后在37℃搖床 上培養45分鐘，搖床轉速為150rpm。然后將細菌涂布在含100μg/ml氨芐青 霉素(Amp)的LB平板(蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl10g、瓊脂1.5g、加水至 1L(pH7.0))上，37℃培養12小時。平板上長出的單個菌落即為陽性轉化子。

C、融合蛋白的表達；將單個的陽性轉化子接種到5ml含50μg/ml氨芐青 霉素(Amp)的LB培養基中37℃培養12小時，活化后菌液按1∶100接入在含 有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養基的搖瓶中20℃搖動培養，搖床轉速為 250rpm。當OD₆₀₀值達到0.6-0.8時加入終濃度為0.5mM的IPTG(異丙基-β-D- 硫代半乳糖苷)誘導6-8小時。細胞經4500rpm離心15分鐘后收集并懸浮在含 有200mM?NaCl的20mM?TrisHCl緩沖液中(pH7.4)，超聲波破碎，12000rpm離心 收集上清液。