[發明專利]在大腸桿菌中高效表達可溶性細菌漆酶的方法

有效

• 申請號: 201010103875.6
• 申請日: 2010-02-02
• 公開（公告）號: CN101736026A
• 公開（公告）日: 2010-06-16
• 發明（設計）人: 王行國;李洋;龔子君;左文峰
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N9/02;C12R1/19;C12R1/22;C12R1/01
• 代理公司: 武漢金堂專利事務所 42212
• 代理人: 丁齊旭

1.在大腸桿菌中高效表達可溶性細菌漆酶的方法，其特征在于包括以下步驟：

A、麥芽糖結合蛋白-細菌漆酶基因的構建：

(1)在50μl的體系中，加入5μl?10×限制性內切酶反應緩沖液，并按1μg?DNA∶3-5U 限制性內切酶的比例加入DNA和限制性內切酶，混勻后37℃保溫2-12小時，使用該方法 分別用相同的限制性內切酶消化切割pMAL-c2x質粒DNA和細菌漆酶基因DNA；

(2)用1％瓊脂糖凝膠電泳分離限制性內切酶消化樣品，在紫外燈下用刀片切出目的 DNA片段，然后按DNA片段回收試劑盒的方法回收目的DNA片段；

(3)在25μl的體系中，加入2.5μl?10×T₄DNA連接酶反應緩沖液，并按1∶5的比例 加入限制性內切酶消化過的pMAL-c2x質粒DNA和細菌漆酶基因DNA，再加入1μlT4DNA 連接酶，16℃水浴4-12小時將細菌漆酶基因插入pMAL-c2x質粒上的多克隆位點，使細 菌漆酶基因連接在pMAL-c2x質粒上攜帶的麥芽糖結合蛋白基因malE的后面，形成一個 重組表達質粒；

B、陽性轉化子的篩選：利用常規的CaCl₂法制備E.coli?DH10B感受態細胞，然后 將5-10μl連接反應混合物與100μl?E.coli?DH10B感受態細胞混合，冰浴30分鐘，42℃ 熱休克1.5分鐘后立即置冰上5分鐘，加入900μl新鮮LB培養基后在37℃搖床上培養 45分鐘，搖床轉速為150rpm，然后將細菌涂布在含100μg/ml氨芐青霉素(Amp)的LB 平板上，37℃培養12小時，平板上長出的單個菌落即為陽性轉化子；

新鮮LB培養基組成為蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl10g、加水至1L、pH7.0；

LB平板組成為蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl10g、瓊脂1.5g、加水至1L、pH7.0；

C、融合蛋白的表達：將單個的陽性轉化子接種到5ml含50μg/ml氨芐青霉素(Amp) 的LB培養基中37℃培養12小時，活化后菌液按1∶100接入在含有50μg/ml氨芐青霉 素的LB培養基的搖瓶中20℃搖動培養，搖床轉速為250rpm，當OD₆₀₀值達到0.6-0.8時 加入終濃度為0.5mM的IPTG(異丙基-β-D-1硫代半乳糖苷)誘導6-8小時，細胞經 4500rpm離心15分鐘后收集并懸浮在含有200mM?NaCl的20mM?TrisHCl緩沖液中，其 pH7.4，超聲波破碎，12000rpm離心收集上清液；

D、可溶性融合蛋白的鑒定：取10-15μl上清液上樣，經10％SDS-PAGE電泳120V、1.5 小時后，考馬斯亮藍染色1小時，與單一細菌漆酶基因表達的可溶性漆酶蛋白相比，可溶 性融合酶蛋白的比例提高到65％以上，單一細菌漆酶基因表達的可溶性漆酶蛋白比例 ＜10％；

E、融合蛋白的純化：將50ml上清粗酶液與10ml麥芽糖親和層析樹脂混合，4℃緩 慢搖動4-12小時，然后將混合物裝柱并用緩沖液A平衡，流速為1ml/min，用緩沖液A 洗柱10-15個床體積后，再用緩沖液B洗脫，流速為1ml/min，收集洗脫液，目的蛋白經 10％SDS-PAGE電泳鑒定，純化后的蛋白經65％硫酸銨沉淀濃縮后再用50mM?pH7.2的磷 酸緩沖液透析去除殘余的硫酸銨，在實驗室搖瓶發酵條件下，從培養物中可獲得純蛋白；

緩沖液A為20mM?TrisHCl?pH7.4、200mM?NaCl，

緩沖液B為20mM?TrisHCl?pH7.4、200mM?NaCl、10mM麥芽糖；

F、酶動力學參數測定：使用漆酶底物ABTS(2，2’-聯氮基-雙(3-乙基苯丙噻唑啉-6- 磺酸))和DMP(2，6-二甲基苯)檢測，麥芽糖結合蛋白-細菌漆酶融合蛋白具有與未融合的 細菌漆酶相似的酶動力學參數，以DMP為底物時，反應體系為pH8.0的50mM?TrisHCl、 0.2mM?CuSO₄和濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.6、1mM的DMP，以ABTS為底物時，反應 體系為pH3.0的50mM醋酸緩沖液、0.2mM?CuSO₄和濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、 1.0、2mM的ABTS，在反應體系中加入1-5μl適量稀釋的純酶后啟動反應，用MV-2550型 紫外分光光度計在37℃條件下測定酶動力學參數Km、Vmax和Km/Vmax值。