[發明專利]一種流感病毒疫苗的生產方法

無效

• 申請號: 201010103784.2
• 申請日: 2010-02-01
• 公開（公告）號: CN101818131A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發明（設計）人: 高鵬;劉玉才;胡來根;王立斌;嚴成;徐志春
• 申請（專利權）人: 成都天邦生物制品有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 四川省成都市天策商標專利事務所 51213
• 代理人: 楊剛

技術領域

本發明涉及一種應用生物反應器微載體細胞培養生產禽流感病毒以及其它流感病毒如豬流感，犬流感，馬流感的流感疫苗的方法。可用于工業化生產禽流感病毒以及其它流感病毒如豬流感，犬流感，馬流感的流感疫苗，替代傳統的雞胚培養法。

背景技術

目前，國內禽流感病毒以及其它流感病毒如豬流感，犬流感，馬流感的流感疫苗生產唯一依靠雞胚法實現。該傳統工藝勞動強度大，耗時長、效率低，生產成本高；容易被環境污染；雞胚不同批次間的差異大；難以擴大生產；雞胚自身被細菌或其它病毒污染而致生產的疫苗或有質量隱患；廢胚數量多，無害化處理難度大，涉及生物安全和公共衛生問題。另外，目前已經有利用生物反應器微載體培養狂犬病疫苗的報道，但尚沒有利用生物反應器微載體生產禽流感病毒以及其它流感病毒如豬流感，犬流感，馬流感的流感疫苗的報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有雞胚法技術存在的不足之處，提供一種應用生物反應器微載體細胞培養生產禽流感病毒以及其它流感病毒如豬流感，犬流感，馬流感的流感疫苗的方法。該方法可以大量降低生產成本，而且生產周期短，不會受制于原料供應，占用場地小，易于快速擴大生產規模，環境污染少且易于處理，自動化程度高，用人少，質量易于實現均衡穩定，顯著提高疫苗產量和質量。

為達到上述目的，本發明采取了如下的技術方案：

一種禽流感病毒以及其它流感病毒如豬流感，犬流感，馬流感的流感疫苗的生產方法，選擇生物反應器作為培養工具；選擇微載體作為細胞貼附生長的載體；選擇MDCK細胞作為制苗用細胞；

包括如下步驟：

(1)制苗用細胞的傳代與培養：取細胞培養瓶中生長良好的MDCK細胞，經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液在細胞培養瓶中繼續培養，培養溫度為37℃，形成良好細胞單層時，用于繼續傳代或接種于生物反應器中進行微載體懸浮培養；

(2)制苗用毒種的繁殖：將基礎毒種10-4稀釋，尿囊腔接種11日齡SPF雞胚，0.1ml/枚，置37℃孵化，每天照蛋2～4次，收獲36～96小時死亡雞胚的尿囊液，置-18℃保存。將此病毒液作為生產種毒.

(3)MDCK細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養：取步驟(1)中已形成良好單層的細胞培養瓶上生長良好的MDCK細胞，經EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液，細胞計數后按5×10⁵/ml～5×10⁶/ml的細胞密度接種于生物反應器中，在生物反應器中加有微載體，設定培養溫度37℃、PH6.8-7.6、溶氧30％-60％、攪拌速度30-60rpm，進行反應器自動控制、微載體懸浮培養；

(4)制苗毒液的繁殖：觀察微載體上細胞基本長滿，且細胞計數結果達到5×10⁶/ml～5×10⁷/ml后進行接毒操作，所接入種毒為步驟(2)中之種毒，接毒前用含有10ug/ml胰酶的病毒培養液洗滌2-4次。設定培養溫度37℃、PH6.8-7.6、溶氧30％-60％、攪拌速度30-60rpm，進行反應器自動控制培養，接毒后每隔一定時間取反應器中微載體，用顯微鏡觀察細胞病變情況；

(5)病毒液的收獲：待微載體上細胞基本全部脫落，且DO值呈明顯上升趨勢，將反應器內液體連同微載體一起收獲，置-20℃反復凍融兩次，然后經離心或過濾去除細胞碎片，即制得病毒液。

病毒液一般于-20℃冷凍保存備用。

上述技術方案中，(1)生物反應器為能夠自動控制溫度、PH、溶氧、攪拌速度等參數，適用于微載體懸浮培養的生物反應器，容積為3L-3000L。上述技術方案中，(3)步驟中的微載體為Cytodex系列微載體5--10g/L，微載體在使用前需清洗、滅菌，方法如下：1)用PBS浸泡微載體過夜；2)用PBS清洗微載體3遍；3)用PBS浸泡微載體，121℃蒸汽滅菌三十分鐘，微載體經清洗、滅菌處理后，加入到已滅菌的生物反應器中，用DMEM清洗。

上述技術方案中，(1)、(3)步驟中的EDTA-胰酶細胞分散液配方為：重量分數分別是0.25％的胰酶(1∶250)、0.02％的EDTA的Hank′s液；細胞生長液的配方為：重量分數分別是90％-98％DMEM液、2％-10％牛血清、加適量的抗菌素，PH為6.8-7.6。

上述技術方案中，(4)步驟中的種毒接種量為0.01-0.5MOI、病毒培養液配方為：不含血清，含有胰酶的DMEM液、加適量的抗菌素，PH為6.8-7.6。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：