[發(fā)明專利]一種流感病毒疫苗的生產方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010103784.2
• 申請日: 2010-02-01
• 公開（公告）號: CN101818131A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發(fā)明（設計）人: 高鵬;劉玉才;胡來根;王立斌;嚴成;徐志春
• 申請（專利權）人: 成都天邦生物制品有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 四川省成都市天策商標專利事務所 51213
• 代理人: 楊剛

1.一種流感病毒疫苗的生產方法，其特征在于：

選擇生物反應器作為培養(yǎng)工具；選擇微載體作為細胞貼附生長的載體；選擇MDCK細胞作為制苗用細胞；

并包括如下步驟：

(1)制苗用細胞的傳代與培養(yǎng)：取細胞培養(yǎng)瓶中生長良好的MDCK細胞，經(jīng)EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液在細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，形成良好細胞單層時，用于繼續(xù)傳代或接種于生物反應器中進行微載體懸浮培養(yǎng)；

(2)制苗用毒種的繁殖：將基礎毒種10^-4稀釋，尿囊腔接種11日齡SPF雞胚，0.1ml/枚，置37℃孵化，每天照蛋2-4次，收獲36～96小時死亡雞胚的尿囊液，置-18℃保存。將此病毒液作為生產種毒。

(3)MDCK細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養(yǎng)：取步驟(1)中已形成良好單層的細胞培養(yǎng)瓶上生長良好的MDCK細胞，經(jīng)EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液，細胞計數(shù)后按5×10⁵/ml～5×10⁶/ml的細胞密度接種于生物反應器中，在生物反應器中加有微載體，設定培養(yǎng)溫度37℃、PH6.8-7.6、溶氧30％-60％、攪拌速度30-60rpm，進行反應器自動控制、微載體懸浮培養(yǎng)；

(4)制苗毒液的繁殖：觀察微載體上細胞基本長滿，且細胞計數(shù)結果達到5×10⁶/ml～5×10⁷/ml后進行接毒操作，所接入種毒為步驟(2)中之生產種毒，接毒前用含有10ug/ml胰酶的病毒培養(yǎng)液洗滌2-4次。設定培養(yǎng)溫度37℃、PH6.8-7.6、溶氧30％-60％、攪拌速度30-60rpm，進行反應器自動控制培養(yǎng)，接毒后每隔一定時間取反應器中微載體，用顯微鏡觀察細胞病變情況；

(5)病毒液的收獲：待微載體上細胞基本全部脫落，且DO值呈明顯上升趨勢，將反應器內液體連同微載體一起收獲，置-20℃反復凍融兩次，然后經(jīng)離心或過濾去除微載體及細胞碎片，即制得病毒液。

2.根據(jù)權利要求1所述的流感疫苗的生產方法，其特征在于：所述的生物反應器為能夠自動控制溫度、PH、溶氧、攪拌速度等參數(shù)，適用于微載體懸浮培養(yǎng)的生物反應器，容積為3L-3000L。

3.根據(jù)權利要求1所述的流感疫苗的生產方法，其特征在于：所述的微載體為Cytodex系列微載體。

4.根據(jù)權利要求3所述的流感疫苗的生產方法，其特征在于：所述的微載體在使用前需清洗、滅菌，方法如下：1)用PBS浸泡微載體過夜；2)用PBS清洗微載體3遍；3)用PBS浸泡微載體，121℃蒸汽滅菌三十分鐘，微載體經(jīng)清洗、滅菌處理后，加入到已滅菌的生物反應器中，用DMEM清洗。

5.根據(jù)權利要求1所述的流感疫苗的生產方法，其特征在于：所述的EDTA-胰酶細胞分散液配方為：質量體積濃度分別是0.25％的規(guī)格為1∶250的胰酶、0.02％的EDTA的Hank′s液。

6.根據(jù)權利要求1所述的流感疫苗的生產方法，其特征在于：所述的細胞生長液的配方為：重量分數(shù)分別是90％-98％DMEM液、2％-10％牛血清，在細胞生長液中另加入各100-500單位/ml的抗菌素，PH為6.8-7.6。

7.根據(jù)權利要求1所述的流感疫苗的生產方法，其特征在于：所述的步驟(4)中的病毒培養(yǎng)液為含有胰酶的DMEM液，并在DMEM液中加入各100-500單位/ml的抗菌素，PH為6.8-7.6。

8.根據(jù)權利要求6或7所述的流感疫苗的生產方法，其特征在于：所述的抗菌素為青霉素鈉和硫酸鏈霉素的混合物。

9.根據(jù)權利要求1所述的流感疫苗的生產方法，其特征在于：所述的步驟(4)中的種毒接種量為0.01-0.5MOI。

10.根據(jù)權利要求1所述的流感疫苗的生產方法，其特征在于：所述的流感疫苗包括禽流感、豬流感、犬流感、馬流感疫苗。