[發明專利]豬流行性腹瀉病毒的生產方法

有效

• 申請號: 201010103700.5
• 申請日: 2010-02-01
• 公開（公告）號: CN101748102A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發明（設計）人: 徐宏軍;胡來根;劉玉才
• 申請（專利權）人: 成都天邦生物制品有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 四川省成都市天策商標專利事務所 51213
• 代理人: 伍孝慈

1.一種豬流行性腹瀉病毒的生產方法，其特征在于：

選擇生物反應器作為培養工具；選擇微載體作為細胞貼附的生長載體；選擇VERO細胞作為制苗用細胞系；

并包括如下步驟：

(1)制苗用細胞的傳代與培養：取VERO細胞，經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液培養，培養溫度為35-38℃；形成良好細胞單層時，用于繼續傳代或接種于生物反應器中進行微載體懸浮培養；

(2)細胞毒種的繁殖：用病毒培養液將豬流行腹瀉病毒種毒按0.5-5％比例接種到步驟(1)形成的良好細胞單層繼續培養，至細胞50-100％以上病變時收獲病毒液；再將此病毒液作為種毒，在細胞上進行細胞適應性連續傳代復壯，每次傳代產物進行病毒TCID₅₀和無菌檢測，傳至病毒TCID₅₀穩定且達到10^7.0TCID₅₀/mL以上時停止復壯，作為生產種子；

(3)VERO細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養：生物反應器按總體積的30％-80％加入無菌細胞生長液，且每升無菌細胞生長液中按3-10g/L濃度加入微載體，啟動生物反應器，低轉速攪拌30分鐘后，取步驟(1)轉瓶上生長良好的VERO細胞，經EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液，細胞計數后按1～3×10⁵個/mL的密度接種到反應器中，設定適合的溫度、PH、攪拌速度、溶氧含量培養參數，進行反應器自動控制培養；

(4)制苗毒液的繁殖：待觀察微載體上細胞長滿80％-90％，空?球率低于5％，滿球率大于80％，細胞狀態良好，且細胞計數結果達到3～5×10⁶個/mL以上進行接毒操作，按0.5-5％比例接入步驟(2)制備好的豬流行性腹瀉病毒種毒，設定適合的溫度、PH、攪拌速度、溶氧含量培養參數，進行反應器自動控制培養；接毒后每隔一定時間取反應器中微載體，用顯微鏡觀察細胞病變情況，并檢測樣品的TCID₅₀；待觀察微載體上細胞基本全部脫落，且DO值呈明顯上升趨勢，停止反應器攪拌，待微載體全部沉到反應器底部后，收獲上清液和微載體；

(5)收獲病毒液的處理：收獲上清液和微載體經2-3次凍融后，離心或過濾去除細胞碎片后-20℃冷凍保存備用；

其中，所述的生物反應器為能夠自動控制溫度、PH、溶氧含量、攪拌速度參數，適用于微載體懸浮培養的生物反應器，容積為3L-3000L；

所述的微載體為Cytodex系列微載體，微載體在使用前需清洗、滅菌，方法如下：1)用PBS浸泡微載體三小時以上；2)用PBS清洗微載體3遍；3)用PBS浸泡微載體，121℃蒸汽滅菌三十分鐘；

所述的EDTA-胰酶細胞分散液配方為：質量體積分數分別是0.25％的規格為1∶250的胰酶、0.02％的EDTA的Hank′s液；

所述的細胞生長液的配方為：質量分數分別是90％-98％DMEM液、2％-10％牛血清，并含有終濃度為100-200IU/mL的抗菌素，PH為6.8-7.6；

所述的種毒接種量為0.5-5％，病毒培養液配方為：含血清1-4％的DMEM液、終濃度為100-200IU/mL的抗菌素，PH調整為7.2-7.4；?

所述的生物反應器設定參數為：培養溫度33-38℃、PH6.5-7.68、溶氧含量30％-70％、攪拌速度30-80rpm。?