[發(fā)明專利]豬流行性腹瀉病毒的生產(chǎn)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010103700.5
• 申請(qǐng)日: 2010-02-01
• 公開（公告）號(hào): CN101748102A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐宏軍;胡來(lái)根;劉玉才
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都天邦生物制品有限公司
• 主分類號(hào): C12N7/00
• 分類號(hào): C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 四川省成都市天策商標(biāo)專利事務(wù)所 51213
• 代理人: 伍孝慈

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種應(yīng)用生物反應(yīng)器微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)疫苗的方法，可用于工業(yè)化生產(chǎn)豬流行腹瀉疫苗，替代傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法生產(chǎn)工藝。

背景技術(shù)

目前，國(guó)內(nèi)豬流行性腹瀉疫苗生產(chǎn)唯一依靠細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法實(shí)現(xiàn)。該傳統(tǒng)工藝勞動(dòng)強(qiáng)度大，耗時(shí)長(zhǎng)、效率低，生產(chǎn)成本高；容易被環(huán)境污染；不同生產(chǎn)批次間或同一生產(chǎn)批次不同瓶間的差異大；難以擴(kuò)大生產(chǎn)；容易出現(xiàn)被細(xì)菌或其它病毒污染而致的疫苗質(zhì)量隱患，涉及生物安全和公共衛(wèi)生問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法技術(shù)存在的不足之處，提供一種應(yīng)用生物反應(yīng)器微載體細(xì)胞培養(yǎng)高效生產(chǎn)豬流行性腹瀉疫苗的方法。該方法可以大量降低生產(chǎn)成本，而且生產(chǎn)周期短，占用場(chǎng)地小，易于快速擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，環(huán)境污染少且易于處理，自動(dòng)化程度高，用人少，質(zhì)量易于實(shí)現(xiàn)均衡穩(wěn)定。可顯著提高豬流行性腹瀉病毒的單位效價(jià)以及疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取了如下的技術(shù)方案：

一種豬流行性腹瀉病毒的生產(chǎn)方法，包括如下步驟：

(1)制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)：取VERO細(xì)胞，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化傳代，以“細(xì)胞生長(zhǎng)液”培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35-38℃；形成良好細(xì)胞單層時(shí)，用于繼續(xù)傳代或接種于生物反應(yīng)器中進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)；

(2)細(xì)胞毒種的繁殖：用“病毒培養(yǎng)液”將豬流行腹瀉病毒種毒按0.5-5％比例接種到步驟(1)形成的良好細(xì)胞單層繼續(xù)培養(yǎng)，至細(xì)胞50-100％以上病變時(shí)收獲病毒液；再將此病毒液作為種毒，在細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞適應(yīng)性連續(xù)傳代復(fù)壯，每次傳代產(chǎn)物進(jìn)行病毒TCID₅₀和無(wú)菌檢測(cè)，傳至病毒TCID₅₀穩(wěn)定且達(dá)到10^7.0TCID₅₀/mL以上時(shí)停止復(fù)壯，作為生產(chǎn)種子；

(3)VERO細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng)：生物反應(yīng)器按總體積的30％-80％加入無(wú)菌“細(xì)胞生長(zhǎng)液”，且每升無(wú)菌細(xì)胞生長(zhǎng)液中按3-10g/L濃度加入微載體，啟動(dòng)生物反應(yīng)器，低轉(zhuǎn)速攪拌30分鐘后，取步驟(1)轉(zhuǎn)瓶上生長(zhǎng)良好的VERO細(xì)胞，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化制備為細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按按1～3×10⁵個(gè)/mL的密度接種到反應(yīng)器中，設(shè)定適合的溫度、PH、攪拌速度、溶氧含量等培養(yǎng)參數(shù)，進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制培養(yǎng)。

(4)制苗毒液的繁殖：待觀察微載體上細(xì)胞長(zhǎng)滿80％-90％，空球率低于5％，，滿球率大于80％，細(xì)胞狀態(tài)良好，且細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果達(dá)到3～5×10⁶個(gè)/mL以上進(jìn)行接毒操作，按0.5-5％比例接入步驟(2)制備好的豬流行性腹瀉病毒種毒，設(shè)定適合的溫度、PH、攪拌速度、溶氧含量等培養(yǎng)參數(shù)，進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制培養(yǎng)；按0.1-5％的比例接入豬流行腹瀉病毒種毒毒液，接毒后每隔一定時(shí)間取反應(yīng)器中微載體，用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，并檢測(cè)樣品的TCID₅₀；待觀察微載體上細(xì)胞基本全部脫落，且DO值呈明顯上升趨勢(shì)，停止反應(yīng)器攪拌，待微載體全部沉到反應(yīng)器底部后，收獲上清液和微載體；

(5)收獲病毒液的處理：收獲上清液和微載體經(jīng)2-3次凍融后，離心或過(guò)濾去除細(xì)胞碎片后-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

上述技術(shù)方案中，生物反應(yīng)器為能夠自動(dòng)控制溫度、PH、溶氧含量、攪拌速度等參數(shù)，適用于微載體懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器，容積為3L-3000L。

上述技術(shù)方案中，微載體為Cytodex系列微載體，微載體在使用前需清洗、滅菌，方法如下：1)用PBS浸泡微載體三小時(shí)以上；2)用PBS清洗微載體3遍；3)用PBS浸泡微載體，121℃蒸汽滅菌三十分鐘。

上述技術(shù)方案中，“EDTA-胰酶細(xì)胞分散液”配方為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是0.25％的胰酶(1∶250)、0.02％的EDTA的Hank′s液；

上述技術(shù)方案中，“細(xì)胞生長(zhǎng)液”的配方為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是90％-98％DMEM液、2％-10％牛血清、終濃度為100-200IU/mL的抗菌素，PH為6.8-7.6。

上述技術(shù)方案中，種毒接種量為0.5-5％，

上述技術(shù)方案中，“病毒培養(yǎng)液”配方為：含血清1-4％的DMEM液、終濃度為100-200IU/mL的抗菌素，PH調(diào)整為7.2-7.4。

上述技術(shù)方案中，生物反應(yīng)器設(shè)定參數(shù)為：培養(yǎng)溫度33-38℃、PH6.5-7.68、溶氧含量30％-70％、攪拌速度30-80rpm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：