[發(fā)明專利]具合成頭孢菌素酸類酶活性的生物催化劑的制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010102824.1
• 申請(qǐng)日: 2010-01-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102296057A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣用;斯克利亞仁科·安娜;張翔;庫(kù)偌什金娜·瓦連金娜;胡遠(yuǎn)輝;薩塔偌娃·熱尼;賈愛(ài)瓊;克列斯季安洛瓦·伊琳娜;周亮;亞諾斯基·舍戈;熊輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)總公司四川抗菌素工業(yè)研究所;俄羅斯聯(lián)邦國(guó)家科學(xué)中心工業(yè)微生物遺傳育種研究所
• 主分類號(hào): C12N11/08
• 分類號(hào): C12N11/08;C12N9/00;C12R1/19
• 代理公司: 成都和睿達(dá)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 51217
• 代理人: 陶紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及采用含頭孢菌素酸合成活性的大腸埃希菌細(xì)胞制備非均相生物催化劑(Biocatalyst，BC)的方法。

背景技術(shù)

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，具有青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶活性的細(xì)胞的固定化方法主要采用戊二醛交聯(lián)處理細(xì)胞，經(jīng)戊二醛交聯(lián)后的細(xì)胞增強(qiáng)了細(xì)胞壁的通透性，有助于滲透到多聚酰胺球形顆粒中。膠粒制備的聚合工藝始于氧化還原對(duì)，其中，N，N，N′，N′-四甲基乙二胺是促進(jìn)劑，過(guò)硫酸銨是引發(fā)劑。現(xiàn)有的生物催化劑是特指把青霉素G經(jīng)酶法水解生成6-氨基青霉烷酸產(chǎn)物(6-APA)的酶，但生物催化的酶活性很低，不到8U/g。

已知的微生物細(xì)胞(包括大腸埃希氏菌細(xì)胞)的固定化方法是將細(xì)胞共價(jià)結(jié)合到交叉連接多聚物(膠)上，而多聚物則是通過(guò)不同的單體，主要是丙烯酸單體，共聚作用生成的。在聚合過(guò)程中，細(xì)胞要么與制備好的聚合物結(jié)合，要么與單體結(jié)合起來(lái)后再用多功能基的聯(lián)結(jié)劑如戊二醛進(jìn)行處理。在細(xì)胞與聚合物或者單體結(jié)合之前，需先經(jīng)包括戊二醛在內(nèi)的含多功能基的交聯(lián)劑處理。β-二甲基氨基丙腈與過(guò)硫酸銨形成的氧化還原對(duì)引發(fā)單體聚合。已報(bào)道的專利都沒(méi)有生物催化劑固定化大腸埃希氏菌細(xì)胞的制備實(shí)例，但包含了具有青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶活性的雷極氏變形桿菌(roteusrettgeri)細(xì)胞的固定化方法的介紹，此方法可用于具有酶水解青霉素G生成6-APA活性的生物催化劑的制備。即使以最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)式存在，此生物催化劑的操作穩(wěn)定性仍然很差，催化青霉素G水解進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，反應(yīng)約60個(gè)小時(shí)后，生物催化劑的活性降低2倍。

把與本發(fā)明方法最接近的文獻(xiàn)方法叫做原型方法。

本發(fā)明為具有催化β-內(nèi)酰胺類抗生素轉(zhuǎn)化活性的生物催化劑固定化細(xì)胞的制備方法。原型方法中，水解青霉素G的生物催化劑的制備是通過(guò)截留大腸埃希氏菌細(xì)胞中的青霉素酰胺酶(青霉素水解酶)進(jìn)入多聚酰胺的膠來(lái)實(shí)現(xiàn)的。原型方法由以下幾點(diǎn)構(gòu)成：大腸埃希氏菌菌株ATCC?9637在含有有機(jī)碳源和有機(jī)氮源及無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)。生物合成進(jìn)行24小時(shí)。生物培養(yǎng)終止點(diǎn)無(wú)任何特別的判據(jù)。將培養(yǎng)的菌絲體懸浮于聚丙烯酰胺膠單體(丙烯酰胺和N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺)，向混合物中加入聚合促進(jìn)劑(β-二甲基氨基丙腈)和引發(fā)劑(過(guò)硫酸鉀)，膠即形成。細(xì)胞的加入量為每克聚合混合物加入33mg干重細(xì)胞，即C_c.b.＝33mg干重/g聚合混合物；將聚合生成的凝膠切成小顆粒，再用水洗滌。

原型方法的主要缺點(diǎn)如下：細(xì)胞在固定化時(shí)缺少的共價(jià)交聯(lián)的固著點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致酶轉(zhuǎn)化形成的目標(biāo)產(chǎn)品有被天然有機(jī)混合物污染的可能，例如反應(yīng)一開(kāi)始就會(huì)被從生物催化劑上脫落的蛋白所污染；且原型方法固定化的細(xì)胞活性比較低。原型方法生物催化劑的酶活僅為22U/g(按水解青霉素G來(lái)計(jì)算)。對(duì)于催化β-內(nèi)酰胺類抗生素的合成特別是頭孢菌素酸的合成，該方法制備的生物催化劑的活性很難確定。

參照原型方法實(shí)施細(xì)胞固定化，用大腸埃希氏菌VKPM?B-10182菌株細(xì)胞(見(jiàn)實(shí)施例3)生成頭孢菌素酸合成酶，能夠得到有頭孢唑啉合成酶活性的生物催化劑即固定化細(xì)胞，其活性(以合成頭孢唑啉計(jì))約40U/g濕細(xì)胞(相當(dāng)于300U/g干細(xì)胞)，固定化收率約50％。但這些生物催化劑活性低，不宜用于裝有攪拌的批量反應(yīng)器中進(jìn)行反應(yīng)。在此種反應(yīng)器中合成則需要生物催化劑的活性不低于60U/g濕細(xì)胞(相當(dāng)于330U/g干細(xì)胞)。按照原型方法生產(chǎn)的生物催化劑的活性也差。在加速失活條件下(40℃，pH6.5)生物催化劑失活一半的時(shí)間(半衰期)僅為20小時(shí)：這不僅是酶的熱失活，而且是酶從其膠質(zhì)流失的機(jī)械性損失。溫和條件下(1g生物催化劑置于3ml緩沖液，20℃，1小時(shí))單一生物催化劑用pH7.5的0.1M磷酸鹽緩沖液沖洗，合成酶活性的損失約為30％。上清液中脫落的蛋白總量結(jié)果顯示每1g蛋白損失5mg目標(biāo)蛋白。由于酶轉(zhuǎn)化合成的目標(biāo)產(chǎn)物會(huì)不可避免地遭到脫落蛋白質(zhì)類的污染，因此使用這樣的生物催化劑來(lái)催化合成β-內(nèi)酰胺類抗生素幾乎是不可能的。

發(fā)明內(nèi)容

該項(xiàng)技術(shù)發(fā)明旨在解決以下問(wèn)題：

如何提高具有合成頭孢菌素酸活性的生物催化劑的活性；

如何提高具有合成頭孢菌素酸活性的生物催化劑的穩(wěn)定性；

制備的生物催化劑在使用其催化合成的目標(biāo)產(chǎn)物過(guò)程中蛋白質(zhì)不會(huì)脫落，所以不會(huì)造成目標(biāo)產(chǎn)物的污染。

本發(fā)明通過(guò)連續(xù)使用多項(xiàng)條件優(yōu)化的技術(shù)手段來(lái)解決前述原型方法制備生物催化劑過(guò)程中存在的問(wèn)題。