[發明專利]一種基于毛細管區帶電泳方式的細胞活性檢測方法

無效

• 申請號: 201010102635.4
• 申請日: 2010-01-29
• 公開（公告）號: CN101782509A
• 公開（公告）日: 2010-07-21
• 發明（設計）人: 屈鋒;丁金美;張璐;江倫;郝帥;胡美齡
• 申請（專利權）人: 北京理工大學
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33;C12Q1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種基于毛細管區帶電泳方式的細胞活性檢測方法，屬于生物 細胞活性檢測技術領域。

背景技術

細胞活性和毒性檢測在細胞生物學、細胞毒理學、藥物研發等領域應用極 其廣泛，是生物學、醫學中重要的技術和手段。近年來，根據細胞死亡過程中 的各個狀態的細胞特性變化，建立了多種細胞活性檢測方法。常規細胞活性檢 測方法主要有細胞計數法、臺盼藍拒染法、中性紅染色法、四噻唑藍(MTT) 比色法、乳酸脫氫酶(LDH)漏出率檢測等方法。在細胞活性檢測過程中，顯 微鏡、酶標儀和流式細胞儀等儀器發揮著重要的作用。

顯微鏡觀察是推動細胞生物學發展的技術手段，也是細胞活性檢測的基本 手段。而熒光顯微鏡的使用，使得這種技術手段在細胞活性檢測方面發揮了更 大的作用。運用顯微鏡觀察來檢測細胞活性，通常是將細胞染色、制片后，顯 微鏡直接觀察、拍照。該方法是通過肉眼觀察，從形態學或染色程度分辨活細 胞或死細胞，人工判斷細胞的染色程度和數目，借此判斷細胞的活性。但是， 這種方法主要依靠人眼的主觀判斷，易引起較大的人為誤差。

酶標儀檢測是根據細胞群體染色后的吸光值大小判斷細胞活性。其中的四 噻唑藍(MTT)比色法是進行細胞活性判斷的常用方法。MTT染料被活細胞攝 取后，可被線粒體脫氫酶氧化生成紫色結晶，其生成量與活細胞數成正比。MTT 法利用測量組的吸光度值與對照組相比得出的百分率作為所測細胞的存活率， 表征細胞活性。此外，還有利用活細胞染料進行染色的方法，細胞群體染色后 的吸光值與活細胞數目成正比，根據吸光值的差異可判斷活細胞的數目，從而 得出細胞群體的相對活性。該方法的不足是僅考慮了活細胞的數目，而不能結 合更多因素測定細胞活性。

流式細胞術是現代細胞分析檢測技術。可高速分析上萬個細胞，快速實現 細胞活性檢測，并可同時從一個細胞中測得多個生物化學參數。但是流式細胞 儀價格昂貴，實驗成本很高，非普通從事生物學研究的科研和醫療單位所能擁 有。而且，由于流式細胞儀儀對人員操作的技術要求高，使其大規模的應用難 以實現。

現代微量分析技術毛細管電泳是通過樣品組分在μm級內徑的毛細管通道 內進行電泳，因組分具有的荷質比差異實現彼此分離。毛細管電泳具有高效、 快速、儀器成本和實驗費用低等明顯優勢。在生物、醫藥和臨床等研究中，毛 細管電泳已廣泛用于生物大分子(蛋白質、核酸等)，有機小分子和無機離子等 的分析檢測，并可用于細胞內的成分分析。毛細管電泳在生物學、醫學、藥學、 環境科學等研究領域具有廣泛的應用，是分析化學的前沿和熱點。

目前，已有連續流毛細管電泳應用于細胞活性檢測的方法報道。例如，文 章“Continuous?intact?cell?detection?and?viability?determination?by?CE?with dual-wavelength?detection，Electrophoresis”(DOI?10.1002/elps.200900417，2010， 31：1-7)介紹的方法，該方法使單細胞連續地通過毛細管檢測窗口，使用紫外 -可見雙波長檢測細胞，其對細胞活性的檢測與表征已經過MTT和臺盼藍染色 兩種常用方法的驗證，結果準確。但是，該方法在實施時，由于單細胞連續電 泳模式的實現依賴于細胞濃度，不易實現，導致對細胞活性的檢測較難實施。 此外，數據處理過程復雜，數據分析較為耗時。

發明內容

本發明的目的在于提供一種毛細管區帶電泳結合二極管陣列檢測器檢測細 胞活性的方法，以克服現有方法存在的人為誤差，儀器設備昂貴、實驗成本高， 不適合高通量分析等不足，實現準確、快速、簡便、成本低且可定性定量檢測 細胞活性。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種基于毛細管區帶電泳方式的細胞活性檢測方法，包括以下步驟：

步驟一、為使毛細管區帶電泳能夠對細胞活性進行檢測，先對待測細胞樣 品進行預處理。即，用細胞染料將待測細胞染色，離心后，棄去上清液，再加 入磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞，直至將殘留細胞染料洗凈為止。之后，向清 洗后的細胞沉淀中加入細胞固定液，由此對細胞進行固定化處理，固定化反應 溫度優選為15-30℃，細胞固定液和固定時間可根據染料特點和細胞性質進行選 擇。最后，用磷酸鹽緩沖液清洗細胞，直至除去剩余的細胞固定液。