[發(fā)明專利]同時檢測兩種木質(zhì)素降解酶功能基因的生物傳感器及其制備和檢測方法及電化學檢測系統(tǒng)

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010102312.5
• 申請日: 2010-01-28
• 公開（公告）號: CN101880627A
• 公開（公告）日: 2010-11-10
• 發(fā)明（設計）人: 湯琳;李貞;曾光明;范長征;黎媛萍;劉燦;晏銘;陳耀寧
• 申請（專利權）人: 湖南大學
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12Q1/68
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所 43008
• 代理人: 趙洪;楊斌

技術領域

本發(fā)明涉及一種生物傳感器及其制備和檢測方法以及該檢測方法中用到的檢測裝置，尤其涉及一種檢測木質(zhì)素降解酶功能基因的生物傳感器及其制備和檢測方法及該檢測方法中用到的檢測裝置。

背景技術

近年來，以功能基因多樣性為核心的分子生態(tài)學研究迅速發(fā)展，為從功能基因角度了解微生物的生態(tài)功能提供了一個新的切入點。研究環(huán)境微生物群落功能基因多樣性分布與表達對了解微生物降解過程的本質(zhì)具有重要意義，通過研究功能基因在自然環(huán)境中的表達調(diào)節(jié)，能更好地弄清微生物在環(huán)境中的真實狀態(tài)及其協(xié)同降解污染物的機理，同時某些特殊的功能基因也能作為檢測特定微生物的靶基因。

黃孢原毛平革菌(Phanerochaete?chrysosporium)是一種白腐真菌，在降解城市生活垃圾堆肥中的木質(zhì)素及多種有機污染物方面具有重要作用。黃孢原毛平革菌能合成兩種木質(zhì)素降解酶：錳過氧化物酶(manganese?peroxidase，MnP)和纖維二糖脫氫酶(cellobiosedehydrogenase，CDH)，MnP合成后被分泌到胞外，經(jīng)過氧化氫啟動一系列自由基鏈反應，依靠氧化還原反應降解各種結構各異的有機物；CDH產(chǎn)生的羥基自由基能抑制一些中間產(chǎn)物的聚合反應，同時消除某些中間產(chǎn)物對酶的失活作用。在堆肥系統(tǒng)中，微生物降解木質(zhì)素的代謝過程由一系列酶共同完成，而MnP和CDH在其中起了關鍵性作用。由于微生物對木質(zhì)素的降解功能取決于其DNA分子中編碼酶的相應功能基因，因此加強木質(zhì)素生物降解酶功能基因的研究能更好地了解微生物降解木質(zhì)素的本質(zhì)及各酶之間的協(xié)同作用，有利于木質(zhì)素降解微生物的篩選，從而促進堆肥充分腐熟，提高堆肥產(chǎn)品的質(zhì)量。

目前，對于木質(zhì)素降解酶編碼基因的檢測多采用Southern印跡雜交法和RT-PCR方法。這些技術對樣品和儀器往往要求很高，在靈敏度和選擇性方面也有一定的缺陷。基因生物傳感器是一種能將目的DNA的存在轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓹z測的電、光、聲等信號的傳感裝置，它與傳統(tǒng)的技術相比，具有快速、靈敏、操作簡單、無污染的特點，并具有分子識別、分離純化基因等功能，已被越來越廣泛地應用于生物、醫(yī)藥、環(huán)境監(jiān)測和食品等領域。

基于酶標記目標物的方法常應用于酶免疫測定中，如酶標記免疫技術，是一種將試劑抗原或試劑抗體用酶進行標記，試劑與標本中相應的抗體或抗原反應后，測定復合物中酶的免疫技術。而雙酶雙標記法常用于醫(yī)學中的免疫組化染色測定中，如檢測同一組織或細胞上不同的抗原，可采用雙重染色技術，選擇兩種酶進行雙重標記免疫染色，并采用一些顯示色差異較明顯的顯色系統(tǒng)對雙重染色結果進行觀察，以此來提高檢測的準確性，為疾病的診斷提供更重要的依據(jù)。由于采用雙酶標記雙目標物的方法在基因檢測方面暫無應用，因此研制一種基于雙酶標記兩種木質(zhì)素降解酶功能基因的生物傳感器對兩種目標基因同時進行快速、可靠的檢測，是本領域技術人員當前面臨的一項十分重要且具創(chuàng)新意義的研究課題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種結構簡單、制作方便、能同時檢測兩種木質(zhì)素降解酶功能基因的生物傳感器，相應還提供一種該生物傳感器的制備方法；本發(fā)明還提供一種簡便快捷、特異性好、抗干擾性好、穩(wěn)定性好、成本低的用該生物傳感器同時檢測兩種木質(zhì)素降解酶功能基因的方法，并相應提供一種該檢測方法中用到的電化學檢測系統(tǒng)。

為解決上述技術問題，本發(fā)明提出的技術方案為一種同時檢測兩種木質(zhì)素降解酶功能基因的生物傳感器，該生物傳感器包括一用作三電極電解池工作電極的金電極，所述金電極上同時固定有編碼錳過氧化物酶(MnP)功能基因的巰基修飾捕獲探針M₁和編碼纖維二糖脫氫酶(CDH)功能基因的巰基修飾捕獲探針C₁，所述金電極表面上除所述捕獲探針M₁和捕獲探針C₁以外的剩余結合位點均采用巰基己醇封閉；

所述捕獲探針M₁的DNA序列為5’-HS-(CH₂)₆-CTGATGGTGTCGTGTTTCT-3’；

所述捕獲探針C₁的DNA序列為5’-HS-(CH₂)₆-TGTCAAAGTGGCAGTTCCCGT-3’。