[發明專利]細菌快速鑒定的試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201010101480.2
• 申請日: 2010-01-27
• 公開（公告）號: CN101921826A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 任緒義;虞閏六;呂江峰;王棟梁
• 申請（專利權）人: 南京迪安醫學檢測中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

1.一種細菌快速鑒定的試劑盒，其特征在于它包括：

(1)擴增細菌16S?rRNA的V1可變區的通用引物：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示引物對；

(2)測序引物：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示；

(3)親和素標記的磁珠；

其中，SEQ?ID?NO：1在其5’端標記生物素；

在一次檢測中共同使用。

2.根據權利要求1所述的細菌快速鑒定的試劑盒，其特征在于它包括如下試劑：

(1)DNA提取試劑：5％(w/v)Chelex?100緩沖液，20mg/mL蛋白酶K；

(2)反應液：PCR?Buffer，特異引物SEQ?ID?NO：1～2，2mM?MgCl₂，0.2mM?dNTPs，2U/μLTaq?DNA聚合酶；

(3)單鏈純化試劑：75％(v/v)乙醇溶液，0.2M?NaOH，10mM?pH?7.6Tris-Acetate，結合緩沖液，退火緩沖液；

(4)測序試劑：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物APS，熒光素和dNTP。

3.一種細菌快速鑒定的試劑盒，其特征在于它包括權利要求1所述的所有核苷酸序列的堿基互補序列，也就是包括：

(1)擴增細菌16S?rRNA的V1可變區的通用引物：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4所示引物對；

(2)測序引物：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示；

(3)親和素標記的磁珠；

其中，SEQ?ID?NO：3在其5’端標記生物素；

在一次檢測中共同使用。

4.根據權利要求3所述的細菌快速鑒定的試劑盒，其特征在于它包括如下試劑：

(1)DNA提取試劑：5％(w/v)Chelex?100緩沖液，20mg/mL蛋白酶K；

(2)反應液：PCR?Buffer，特異引物SEQ?ID?NO：3～4，2mM?MgCl₂，0.2mM?dNTPs，2U/μLTaq?DNA聚合酶；

(3)單鏈純化試劑：75％(v/v)乙醇溶液，0.2M?NaOH，10mM?pH?7.6Tris-Acetate，結合緩沖液，退火緩沖液；

(4)測序試劑：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物APS，熒光素和dNTP。

5.一種細菌快速鑒定的試劑盒的檢測方法，其特征在于它包括如下步驟：

(1)提取細菌DNA；

(2)以步驟(1)所得DNA為模板，利用通用引物進行細菌16S?rRNA的V1可變區的PCR擴增；

(3)步驟(2)得到的PCR擴增產物與親和素標記的磁珠結合進行單鏈純化；

(4)將步驟(3)得到的純化的PCR產物進行焦磷酸測序；

(5)測序結果與數據庫比對判斷種屬。

6.根據權利要求5所述的細菌快速鑒定的試劑盒的檢測方法，其特征在于步驟(2)中所述的PCR擴增體系為：10×buffer?5μL，SEQ?ID?NO：11μL，SEQ?ID?NO：21μL，Template?0.2ng，dNTPS?200mM，taqE?2U，加無菌水至50μL；PCR擴增條件為：95℃?3min；94℃?40s，55℃?40s，72℃?60s，40個循環；72℃?10min。

7.根據權利要求5所述的細菌快速鑒定的試劑盒的檢測方法，其特征在于步驟(2)中所述的PCR擴增體系為：10×PCR?Buffer?5μL，SEQ?ID?NO：3?1μL，SEQ?ID?NO：4?1μL，Template?0.2ng，dNTPS?200mM，taqE?2U，加無菌水至50μL；PCR擴增條件為：95℃?3min；94℃?40s，55℃?40s，72℃?60s，40個循環；72℃?10min。