[發明專利]細菌快速鑒定的試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201010101480.2
• 申請日: 2010-01-27
• 公開（公告）號: CN101921826A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 任緒義;虞閏六;呂江峰;王棟梁
• 申請（專利權）人: 南京迪安醫學檢測中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術領域

本發明屬臨床微生物鑒定技術領域，具體涉及一種快速鑒定醫學病原菌的試劑盒及檢測方法。

背景技術

傳統的細菌培養和生化分析，已不能滿足對各種病原微生物的診斷以及流行病學研究，研究者不僅希望在分子水平上對各種細菌和病毒進行研究，同時希望檢驗方法更快速、準確，通量更高，人為影響因素要盡可能減少，便于構建標準化的操作流程。PCR以及定量PCR的方法無法獲得分子診斷的黃金標準-基因序列，而且受檢測菌種的限制，每種菌種需要特異的PCR引物和或探針，大大限制了其在細菌鑒定中的應用；而利用常規的DNA測序技術對大片段的DNA進行序列測定，在速度和消耗上不能滿足對大規模樣本快速檢測的要求。在實際工作中，很短的一段保守/特異序列的測定就可滿足對分子診斷的需要。由于16srRNA序列在所有的細菌種都存在，能夠滿足進行比較的要求，因此以16SrRNA序列分析為基礎，采取毒力和毒素基因鑒定方法，在最短的時間內鑒定未知細菌，對細菌性新發傳染病做出準確判定。焦磷酸測序技術可以快速、準確地進行短DNA序列分析，通量高、操作方便，便于構建標準化操作流程，因此廣受研究者青睞，并在很多方面已應用于臨床微生物的分型鑒定及耐藥檢測。

Pyrosequencing(焦磷酸測序)技術是新一代DNA序列分析技術，該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，操作極為簡便。Pyrosequencing技術是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應，在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸基團(PPi)。PPi可最終轉化為可見光信號，并由PyrogramTM轉化為一個峰值。每個峰值的高度與反應中摻入的核苷酸數目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續DNA鏈的合成。

然而，傳統細菌鑒定方法需要18～24小時，成本也較高，細菌經DNA抽提、通用引物擴增，然后用通用引物作為測序引物，測序結果與數據庫比對判斷型別。該方法能一次測序區分常見臨床細菌，可用于細菌感染的臨床診斷及耐藥監測。迄今為止國內外未見一次測序區分常見臨床細菌的產品和報道，因此臨床上如果要快速獲得細菌感染的信息，需要等18～24小時或更長時間而且成本較高，影響了診療效果。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種菌種快速鑒定的試劑盒。

本發明還要解決的技術問題是提供上述試劑盒的檢測方法。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種細菌快速鑒定的試劑盒，它包括：

(1)擴增細菌16S?rRNA的V1可變區的通用引物：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示引物對；

(2)測序引物：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示；

(3)親和素標記的磁珠；

其中，SEQ?ID?NO：1在其5’端標記生物素；

在一次檢測中共同使用。

上述細菌快速鑒定的試劑盒，具體包括如下試劑：

(1)DNA提取試劑：5％(w/v，即g/mL)Chelex?100緩沖液，20mg/mL蛋白酶K；

其中，Chelex?100緩沖液具體為：含0.03％(w/v，即g/mL)SDS，1％(v/v)Tween-20，1％(v/v)NP-40。

(2)反應液：PCR?Buffer，特異引物SEQ?ID?NO：1～2，2mM?MgCl₂，0.2mM?dNTPs，2U/μLTaq?DNA聚合酶；

其中，PCR?Buffer具體為：0.1％(v/v)NP-40，0.02％(v/v)明膠，0.06％(w/v，即g/mL)BSA，0.1％(v/v)Tween-20，0.06M?pH8.9Tricine。

(3)單鏈純化試劑：75％(v/v)乙醇溶液，0.2M?NaOH，10mM?pH?7.6Tris-Acetate，結合緩沖液，退火緩沖液；

其中，結合緩沖液具體為：10mM?Tris-HCl，2M?NaCl，1mM?EDTA，0.1％(v/v)Tween-20；退火緩沖液具體為：20mM?pH?7.6Tris-Acetate，2mM醋酸鎂。

(4)測序試劑：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物APS，熒光素和dNTP(dNTP即dATP?S，dTTP，dCTP，dGTP)。

一種細菌快速鑒定的試劑盒，它包括上述的所有核苷酸序列的堿基互補序列，也就是包括：