[發明專利]一種利用廉價原料發酵生產D-乳酸的方法

無效

• 申請號: 201010101421.5
• 申請日: 2010-01-27
• 公開（公告）號: CN101988079A
• 公開（公告）日: 2011-03-23
• 發明（設計）人: 王正祥;石貴陽
• 申請（專利權）人: 江蘇銳陽生物科技有限公司
• 主分類號: C12P7/56
• 分類號: C12P7/56;C12N1/21;C12N15/09;C12R1/19
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

技術領域

本發明采用微生物發酵法以工業廢棄甘油作為原料生產D-乳酸，屬于微生物發酵工程技術領域。

背景技術

日益嚴重的全球性能源和環境問題促使世界各國紛紛發展生物柴油技術并構建生物柴油產業，以減緩對石油依賴并降低大氣中溫室氣體排放的上升速度。據統計，2006年全球生物柴油總產量約65億升，較2005年的39億升增長67％，增長速度驚人。根據Global?Industry?Analysts所做的預估，2010年全球生物柴油市場將增長至180億升，比2006年增長177％。隨著世界范圍內生物柴油需求量和生產量的迅猛增長，其經濟生存能力越來越要依賴于對其廢棄副產品甘油(產量按生物柴油產量的10％計算)的有效利用或大規模的轉化。

與此同時，生物可降解材料如聚乳酸的需求也不斷增加，同步推動了對其單體D-乳酸或L-乳酸的需求。近年來，乳酸發酵工藝及聚乳酸高分子材料的研究活躍，乳酸成為一個極具潛力的化學品，并有望成為繼檸檬酸之后的又一大宗發酵產品。然而，外消旋型及低光學純度的乳酸在很多領域的應用受到限制，人們不斷尋找單一光學純度D-乳酸或L-乳酸的生產方法，并探索其以廉價資源為原料，以高產量、高底物轉化率、高生產強度、高化學純度生產的可行性。

因此，如果能有效地將甘油作為原料發酵生產出高光學純度和高化學純度的D-乳酸或L-乳酸，則既可以解決生物柴油或油脂加工中的甘油的回收利用問題，又可以節約D-乳酸的或L-乳酸的生產成本。相對于葡萄糖而言，以甘油為底物合成乳酸具有更高的還原態。劉德華等提出了以甘油為原料發酵生產乳酸的工藝路線，并分離出一株野生菌株，能直接利用未精制的甘油為原料發酵生產乳酸，在5L機械攪拌發酵罐進行通空氣批次發酵研究，72h時發酵液中乳酸濃度68.53g/L，乳酸質量得率0.81，生產強度0.95g/(L·h)(許赟珍，等，過程工程學報，2008)。該課題組在篩選得到的菌株在發酵甘油獲得乳酸的同時，乙酸，琥珀酸，酒精等副產物的終濃度分別達到7.0g/L，3.7g/L，1.4g/L(An-AnHong，et?al，J?Chem?Technol?Biotechnol，2009)。同一課題組還使用相似研究結果申請了國家發明專利(一種利用甘油生產乳酸的方法，專利號：200810102824.4；公開號：CN?101255451A)。但在此申請專利中，申請者使用的為野生細菌，未對菌株的發酵能力進行遺傳改良，也沒有研究其所生產的乳酸是L-型還是D-型或者是混合型，更未對乳酸發酵過程中必須嚴格控制的其它低分子特別是乙酸，琥珀酸的形成或含量嚴格控制，不能以此實施工業應用目的。本發明中以一株經過廣范圍基因修飾的D-乳酸高產菌株為生產菌株，在高效轉化甘油合成乳酸的同時大幅度減少了副產物的生成，合成高光學純度和高化學純度的D-乳酸，并建立了相關的發酵工藝，與上述申請專利完全不同。

大腸桿菌是優秀的乳酸候選產生菌，特別是經過基因組有益改造的大腸桿菌可以快速高效的代謝葡萄糖生成高化學純度和高光學純度的乳酸。如pta和ppc的敲除可以提高乳酸的化學純度(Dong-Eun?Chang，et?al，Applied?and?Environmental?Microbiology，1999)。pflB，aceEF，poxB和pps也被證實可以提高乳酸的化學純度(Y.Zhu，et?al，Applied?and?Environmental?Microbiology，2007)。

大腸桿菌在碳源利用方面存在明顯的葡萄糖效應。當其他碳源和葡萄糖同時存在時，菌株優先利用葡萄糖而其他碳源的利用受到抑制，直到葡萄糖消耗殆盡時菌株才開始利用其他碳源。甘油和葡萄糖同時作為碳源時菌體生長存在二次利用現象，即使不添加葡萄糖，甘油作為唯一碳源時，菌株對甘油的利用也存在明顯的延遲期過長現象。研究表明葡萄糖磷酸轉移酶基因(ptsG)在葡萄糖效應中起著至關重要的作用，突變該基因，阻斷磷酸轉移酶的合成途徑可以有效的解除葡萄糖對其他碳源代謝利用的抑制作用(Ranjini?Chatterjee，et?al，Applied?and?Environmental?Microbiology，2001)。MarkA.Eiteman等的研究成果顯示，除了葡萄糖磷酸轉移酶基因(ptsG)之外，葡萄糖激酶基因(glk)、甘露糖磷酸轉移透性酶(manZ)和木糖異構酶(xylA)在碳源的選擇性利用方面也有重要的影響作用(Mark?A.Eiteman，et?al，Biotechmology?and?Bionengineering，2008)。