[發明專利]一種從植物提取物中篩選1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構化酶抑制劑的方法

無效

• 申請號: 201010100975.3
• 申請日: 2010-01-22
• 公開（公告）號: CN101768627A
• 公開（公告）日: 2010-07-07
• 發明（設計）人: 高文運;李恒;田潔;王輝;楊少青
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: C12Q1/533
• 分類號: C12Q1/533;G01N30/90;G01N30/89;G01N30/02
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 徐平

技術領域

本發明屬于抗生素的篩選領域，涉及一種從植物提取物中篩選1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構化酶(DXR)抑制劑的簡單方法。

背景技術

萜類化合物存在于幾乎所有的生命形式中，它們在生物體中發揮著重要的作用，如長醇焦磷酸酯(dolichol?diphosphates)對細胞壁及糖蛋白生物合成的調節作用；醌類化合物(如質體醌和輔酶Q)可作為電子轉移及氧化還原反應的載體；類胡蘿卜素及葉綠素的側鏈參與光合作用；甾體可幫助構成細胞膜(如膽固醇)；雌激素參與細胞間信號傳遞過程并可控制個體的生長發育；甜椒醇(capsidiol)等可作為抗菌素及植物抗毒素用于物種間相互防御；赤霉素、脫落酸可作為植物激素；維生素A的存在可促進視網膜的正常功能，缺乏則導致夜盲癥；維生素D能促進鈣、磷在腸內的吸收，維持血鈣血磷的平衡，促進骨質的鈣化等。同時，植物中所含的其它一些萜類化合物通常作為植保素，在調節植物與環境的關系上發揮重要的生態功能。許多萜類化合物還具有很好的生物活性，是天然藥物的主要有效成分，如目前廣泛使用的抗瘧藥物青蒿素、抗心血管疾病的銀杏內酯及具有很強抗癌活性的化合物紫杉醇等。

長期以來，生物體內的萜類化合物被認為是由輔酶A經甲羥戊酸而合成，并認為甲羥戊酸是萜類化合物生物合成的唯一前體，故該生物合成途徑被稱為甲羥戊酸途徑。但到上世紀九十年代初，人們發現萜類化合物的生物合成除甲羥戊酸途徑外，還存在一條非甲羥戊酸途徑，由于1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)和2-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸(MEP)是這一新途徑中的兩個重要中間體，故稱為DXP/MEP途徑，現簡稱為MEP途徑。

最新研究證明，動物(包括人類)主要通過經典的甲羥戊酸途徑來合成其所需的萜類化合物，而包括人類的致病菌在內的大多數細菌則是利用MEP途徑來合成其所必需的萜類化合物。這種人類和其主要致病菌分別采用完全不同的生物途徑來合成維持它們生命活動所必需的萜類化合物的事實，為人們提供了一個利用MEP途徑中的酶為靶標進行新型抗菌素篩選的強有力的方法，而使用該方法進行抗菌素篩選的最大優點在于篩選的過程不需考慮藥物的選擇性。因此，這條新發現的MEP途徑在新類型抗菌素的發現方面將具有非常廣闊的應用前景，尤其是在當前病菌對現存的各種抗菌素的耐受性日益提高的情況下。目前，對該生物合成途徑中的酶及它們的作用機理的研究已成為一個熱點，尤其是對1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構化酶(DXR)的研究更加廣泛和深入。

Zenk、Bacher等人(US2009199313等)曾對MEP途徑中酶的抑制劑篩選方法進行了嘗試，但是他們所建立的方法使用的底物都是含有同位素標記的化合物，通過測定產物的生成情況來判斷抑制大小，所采用的檢測方法包括放射性測定法及核磁共振法等，而使用及測定具有放射性的物質時要求有單獨的放射性物質操作室及專門的測定儀器，核磁共振法更是需要昂貴的核磁共振儀，這都使得這些方法很難適合普通實驗室的研究工作。Gottlin等人建立了時間分辨熒光光譜法(time-resolved?fluorescence)，通過測定反應過程中NADPH被氧化時吸收信號的衰減來高通量地篩選DXR的抑制劑(J.Biomol.Screening，2003，8，332-339)，該法不適合植物提取物中DXR抑制劑的篩選，主要是因為植物提取物中的有些成分會干擾測定過程。Kaiser等人研究了地中海地區一些植物的提取物對DXR的抑制情況，發現洋蘇木提取物活性最好，但該法以核磁共振法作為檢測手段，使其應用受到很大限制(Phytomedicine，2007，14，242-249)。

發明內容

本發明的目的在于提供一種簡單快速的DXR抑制劑的篩選方法，該方法適用于在實驗室中采用常見的紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、或反相離子對高效液相色譜法等檢測手段從植物提取物中篩選DXR的抑制劑，解決了背景技術中篩選DXR抑制劑的方法需要大型昂貴的儀器來檢測，如核磁共振儀等，檢測成本高的技術問題。

本發明的技術解決方案如下：

為了解決背景技術中存在的上述技術問題，本發明提供了一種從植物提取物中篩選1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構化酶(DXR)抑制劑的方法。該方法是以常見的色譜方法來檢測底物的消耗量或產物的生成量的分析方法，在此基礎上判斷植物提取物對DXR酶催化活性的影響，進而發現DXR酶的有效抑制劑。

其原理是：

1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構化酶(DXR)催化DXP還原異構化為MEP的過程如以下反應式所示：