[發(fā)明專利]一種從植物提取物中篩選1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構(gòu)化酶抑制劑的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010100975.3
• 申請日: 2010-01-22
• 公開（公告）號: CN101768627A
• 公開（公告）日: 2010-07-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高文運;李恒;田潔;王輝;楊少青
• 申請（專利權(quán)）人: 西北大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/533
• 分類號: C12Q1/533;G01N30/90;G01N30/89;G01N30/02
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 徐平

1.一種從植物提取物中篩選1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構(gòu)化酶抑制劑的方法，其特征在于：該方法包括以下步驟

(1)用于檢測1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構(gòu)化酶抑制劑的樣品的制備

將未標記的底物1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸、輔酶NADPH、1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構(gòu)化酶DXR和二價金屬離子加入到緩沖液中，再加入植物提取物，該反應(yīng)體系反應(yīng)，制備出用于檢測DXR抑制劑的樣品；

(2)對照樣的制備

將未標記的底物1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸、輔酶NADPH、DXR和二價金屬離子加入到緩沖液中，該反應(yīng)體系反應(yīng)，制備出對照樣；

(3)色譜法檢測

用紙色譜法、高效液相色譜法或薄層色譜法檢測步驟(1)的樣品和步驟(2)的對照樣中的1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸的轉(zhuǎn)化情況；以對照樣為參比，根據(jù)各樣品中底物1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸的轉(zhuǎn)化量是否減少來判斷所加植物提取物對DXR活性有無影響，進而篩選出DXR的有效抑制劑。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從植物提取物中篩選DXR抑制劑的方法，其特征在于：步驟(3)色譜法是薄層色譜法時，在色譜檢測前先要對步驟(1)樣品和步驟(2)對照樣進行預(yù)處理，其方法是，分別在步驟(1)樣品和步驟(2)對照樣中加入5-50U的磷酸酶，所述磷酸酶包括堿性磷酸酶或酸性磷酸酶；在30-40℃水浴中繼續(xù)反應(yīng)2-8h，減壓蒸去反應(yīng)混合物中的水，用有機溶劑提取，將提取液減壓濃縮；

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從植物提取物中篩選DXR抑制劑的方法，其特征在于：步驟(3)以預(yù)處理后的對照樣為參比，用硅膠板進行薄層色譜法檢測各預(yù)處理后的樣品中1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸的轉(zhuǎn)化情況，包括以下步驟：

1)點樣及展開：取反應(yīng)樣品及對照樣點樣，點樣量0.5-2μl，展開系統(tǒng)為氯仿∶甲醇∶水＝3∶1∶0.1(v/v/v)或丙酮∶氯仿＝3∶1(v/v)；室溫下展開，待溶劑前沿至硅膠板長度的4/5時，將硅膠板取出，室溫晾干；

2)顯色：晾干的硅膠板噴灑2％-8％硫酸乙醇溶液后90-110℃下加熱5-20min顯色；

3)觀察：觀察硅膠板上DX及ME的斑點變化。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從植物提取物中篩選DXR抑制劑的方法，其特

征在于：步驟(3)以對照樣為參比，用紙色譜法檢測各樣品中1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸的轉(zhuǎn)化情況，包括以下步驟：

1)點樣及展開：取反應(yīng)樣品點樣，點樣量1-10μl，同時以對照樣為參比；展開劑為95％乙醇∶1M乙酸胺∶1M?EDTA＝70∶29∶1(v/v/v)；室溫下展開，待溶劑前沿至濾紙長的2/3位置處，將濾紙取出，室溫下晾干；所述濾紙為實驗室常用定性濾紙；

2)顯色：用5％-20％硫酸乙二胺的水溶液或醇溶液為顯色劑顯色，噴灑后90-110℃下加熱5-20min；或以0.01-0.05M?2，4-二硝基苯肼的1％HCl溶液為顯色劑，噴灑后室溫下放置5-20min；

3)觀察：在紫外燈下觀察樣品與對照樣品中底物1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸轉(zhuǎn)化量的變化情況，進而確定植物提取物對DXR的抑制情況。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從植物提取物中篩選DXR抑制劑的方法，其特征在于：步驟(3)以對照樣為參比，用高效液相色譜法檢測各樣品中1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸的轉(zhuǎn)化情況，包括以下步驟：

1)上樣：取2-10μl待測樣品，1∶10稀釋后過濾進入高效液相色譜法系統(tǒng)中，同時以相同的方式處理對照樣；

2)檢測：反相離子對高效液相色譜法梯度洗脫并檢測待測樣品及對照樣中DXP含量；

3)分析：根據(jù)樣品與對照樣品中底物1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸轉(zhuǎn)化量的差異，分析植物提取物對DXR活性的影響。