[發明專利]小麥花藥愈傷組織基因槍遺傳轉化方法

無效

• 申請號: 201010100814.4
• 申請日: 2010-01-22
• 公開（公告）號: CN101748152A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發明（設計）人: 陳耀鋒;史勇;陳鑫;李春蓮;任慧莉;崔志剛;權軍利;白延紅
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;A01H4/00;A01H1/08
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 李鄭建

技術領域

本發明屬于農業生物技術領域，具體涉及一種小麥花藥愈傷組織基因槍遺傳轉化方法。?

背景技術

小麥是重要的糧食作物之一，自1992年Vasil等將GUS/Bar基因導入小麥獲得首例轉基因小麥以來，轉基因小麥研究有了長足的發展，小麥轉基因的常用方法為基因槍法(microprojectilebombardment)、花粉管通道法(polly?tube?pathway)和農桿菌介導法(Agrobacterium?mediated?transformation)。由于小麥不是農桿菌的天然宿主及禾谷類植物沒有損傷反應現象，所以基因槍轉化一直是小麥遺傳轉化的主要方法，盡管小麥遺傳轉化的方法不少，但各種方法的轉基因效率很低，一個重要的原因是轉化方法不成熟。基因槍轉化的受體多為幼胚、成熟胚及其體細胞愈傷組織，但這些受體在基因槍轟擊后再生率低已成為一個限制因子，同時，經基因槍轉化體細胞獲得的轉基因株是一個外源基因雜合體，須經再自交2代才能選出轉化基因完全純合的個體，育種程序復雜。離體培養中花藥愈傷組織高頻率的再生特性及當代加倍純合特點已引起了人們的重視，利用花藥愈傷組織進行遺傳轉化，不僅愈傷組織再生特性好，而且再生苗直接加倍后即可成為基因型完全純合的穩定雙倍體。?

發明內容

針對上述現有技術存在的缺陷或不足，本發明的目的在于，提供一種小麥花藥愈傷組織基因槍轉化方法，該方法利用小麥花藥愈傷組?織再生頻率高、再生株加倍即為純合二倍體的特點，通過基因槍轟擊、小麥花藥愈傷組織再生與再生株染色體加倍，快速、高效地進行小麥遺傳轉化，克服了傳統的小麥體細胞遺傳轉化中，體細胞愈傷組織再生特性差、遺傳轉化效率低的缺陷。?

為實現上述目的，本發明采用如下的技術方案：?

一種小麥花藥愈傷組織基因槍遺傳轉化方法，包括以下步驟：?

1)小麥花藥愈傷組織誘導：選取小麥花粉細胞發育至單核中期到單核晚期的小麥幼穗，在2℃～4℃條件下低溫放置2天；?

低溫放置后的小麥幼穗經常規消毒后，剝取花藥組織接種在花藥愈傷組織誘導培養基上，于25℃～27℃條件下遮光培養誘導小麥花藥愈傷組織；?

所述的小麥花藥愈傷組織誘導培養基以通用培養基W14為基準，添加以下物質：2，4-二氯苯氧乙酸：2.0?mg/L，酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，蔗糖：100000mg/L，瓊脂粉：5000mg/L；?

調整花藥愈傷組織誘導培養基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋(壓力：1.0kg/cm²)滅菌20分鐘；?

2)高滲培養：小麥花藥組織誘導培養40天后陸續產生花藥愈傷組織，分批挑選小米粒大小、顏色、質地一致的花藥愈傷組織轉移到高滲培養基中培養5h；所述的高滲培養基為愈傷組織誘導培養基再附加0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇；?

3)基因槍轟擊轉化：經高滲培養后的花藥愈傷組織用常規的基因槍轉化方法進行轟擊轉化，基因槍轟擊參數為：金粉直徑1.0μm，阻擋網與轟擊材料之間的距離為6.0cm，可裂膜壓力為1100Pa，每槍金粉/DNA用量為1μg/60μg，每皿材料轟擊1次；?

4)恢復培養：基因槍轟擊后的花藥愈傷組織在上述高滲培養基上繼續培養8h，然后轉移到小麥花藥愈傷組織誘導培養基上恢復培養6h；?

5)分化篩選培養：恢復培養6h后的花藥愈傷組織轉至分化篩選培養基上進行光照分化篩選培養；培養溫度為25～28℃，光照度3000lx，每天光照12h；?

所述的分化篩選培養基以通用培養基W14為基準，添加以下物質：6－呋喃基氨基嘌呤：2.0mg/L，α－奈乙酸：0.1mg/L，酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，蔗糖：30000mg/L，瓊脂粉：5000mg/L；?

調整分化篩選培養基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋滅菌20分鐘；經基因槍轟擊、恢復生長的花藥愈傷組織在分化篩選培養基上分化出芽苗；?

6)壯苗、生根培養：待花藥愈傷組織分化的芽苗長至2～3片葉時轉移到生根、壯苗培養基上，于25℃、3000Lx光照條件下進行壯苗、生根培養；?

所述的壯苗、生根培養基選用通用培養基W14，以通用培養基W14為基準，W14通用培養的無機鹽濃度降低一半，添加α－奈乙酸0.5mg/L，蔗糖：30000mg/L，瓊脂粉：5000mg/L；?

調整壯苗、生根培養基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋滅菌20分鐘；?