[發(fā)明專利]小麥花藥愈傷組織基因槍遺傳轉(zhuǎn)化方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010100814.4
• 申請(qǐng)日: 2010-01-22
• 公開（公告）號(hào): CN101748152A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳耀鋒;史勇;陳鑫;李春蓮;任慧莉;崔志剛;權(quán)軍利;白延紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/87
• 分類號(hào): C12N15/87;A01H4/00;A01H1/08
• 代理公司: 西安恒泰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 61216
• 代理人: 李鄭建

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小麥花藥愈傷組織基因槍遺傳轉(zhuǎn)化方法。?

背景技術(shù)

小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物之一，自1992年Vasil等將GUS/Bar基因?qū)胄←湯@得首例轉(zhuǎn)基因小麥以來，轉(zhuǎn)基因小麥研究有了長(zhǎng)足的發(fā)展，小麥轉(zhuǎn)基因的常用方法為基因槍法(microprojectilebombardment)、花粉管通道法(polly?tube?pathway)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(Agrobacterium?mediated?transformation)。由于小麥不是農(nóng)桿菌的天然宿主及禾谷類植物沒有損傷反應(yīng)現(xiàn)象，所以基因槍轉(zhuǎn)化一直是小麥遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法，盡管小麥遺傳轉(zhuǎn)化的方法不少，但各種方法的轉(zhuǎn)基因效率很低，一個(gè)重要的原因是轉(zhuǎn)化方法不成熟。基因槍轉(zhuǎn)化的受體多為幼胚、成熟胚及其體細(xì)胞愈傷組織，但這些受體在基因槍轟擊后再生率低已成為一個(gè)限制因子，同時(shí)，經(jīng)基因槍轉(zhuǎn)化體細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)基因株是一個(gè)外源基因雜合體，須經(jīng)再自交2代才能選出轉(zhuǎn)化基因完全純合的個(gè)體，育種程序復(fù)雜。離體培養(yǎng)中花藥愈傷組織高頻率的再生特性及當(dāng)代加倍純合特點(diǎn)已引起了人們的重視，利用花藥愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，不僅愈傷組織再生特性好，而且再生苗直接加倍后即可成為基因型完全純合的穩(wěn)定雙倍體。?

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷或不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種小麥花藥愈傷組織基因槍轉(zhuǎn)化方法，該方法利用小麥花藥愈傷組?織再生頻率高、再生株加倍即為純合二倍體的特點(diǎn)，通過基因槍轟擊、小麥花藥愈傷組織再生與再生株染色體加倍，快速、高效地進(jìn)行小麥遺傳轉(zhuǎn)化，克服了傳統(tǒng)的小麥體細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化中，體細(xì)胞愈傷組織再生特性差、遺傳轉(zhuǎn)化效率低的缺陷。?

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：?

一種小麥花藥愈傷組織基因槍遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：?

1)小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)：選取小麥花粉細(xì)胞發(fā)育至單核中期到單核晚期的小麥幼穗，在2℃～4℃條件下低溫放置2天；?

低溫放置后的小麥幼穗經(jīng)常規(guī)消毒后，剝?nèi)』ㄋ幗M織接種在花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于25℃～27℃條件下遮光培養(yǎng)誘導(dǎo)小麥花藥愈傷組織；?

所述的小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以通用培養(yǎng)基W14為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì)：2，4-二氯苯氧乙酸：2.0?mg/L，酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，蔗糖：100000mg/L，瓊脂粉：5000mg/L；?

調(diào)整花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋(壓力：1.0kg/cm²)滅菌20分鐘；?

2)高滲培養(yǎng)：小麥花藥組織誘導(dǎo)培養(yǎng)40天后陸續(xù)產(chǎn)生花藥愈傷組織，分批挑選小米粒大小、顏色、質(zhì)地一致的花藥愈傷組織轉(zhuǎn)移到高滲培養(yǎng)基中培養(yǎng)5h；所述的高滲培養(yǎng)基為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基再附加0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇；?

3)基因槍轟擊轉(zhuǎn)化：經(jīng)高滲培養(yǎng)后的花藥愈傷組織用常規(guī)的基因槍轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轟擊轉(zhuǎn)化，基因槍轟擊參數(shù)為：金粉直徑1.0μm，阻擋網(wǎng)與轟擊材料之間的距離為6.0cm，可裂膜壓力為1100Pa，每槍金粉/DNA用量為1μg/60μg，每皿材料轟擊1次；?

4)恢復(fù)培養(yǎng)：基因槍轟擊后的花藥愈傷組織在上述高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)8h，然后轉(zhuǎn)移到小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)6h；?

5)分化篩選培養(yǎng)：恢復(fù)培養(yǎng)6h后的花藥愈傷組織轉(zhuǎn)至分化篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行光照分化篩選培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為25～28℃，光照度3000lx，每天光照12h；?

所述的分化篩選培養(yǎng)基以通用培養(yǎng)基W14為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì)：6－呋喃基氨基嘌呤：2.0mg/L，α－奈乙酸：0.1mg/L，酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，蔗糖：30000mg/L，瓊脂粉：5000mg/L；?

調(diào)整分化篩選培養(yǎng)基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋滅菌20分鐘；經(jīng)基因槍轟擊、恢復(fù)生長(zhǎng)的花藥愈傷組織在分化篩選培養(yǎng)基上分化出芽苗；?

6)壯苗、生根培養(yǎng)：待花藥愈傷組織分化的芽苗長(zhǎng)至2～3片葉時(shí)轉(zhuǎn)移到生根、壯苗培養(yǎng)基上，于25℃、3000Lx光照條件下進(jìn)行壯苗、生根培養(yǎng)；?

所述的壯苗、生根培養(yǎng)基選用通用培養(yǎng)基W14，以通用培養(yǎng)基W14為基準(zhǔn)，W14通用培養(yǎng)的無機(jī)鹽濃度降低一半，添加α－奈乙酸0.5mg/L，蔗糖：30000mg/L，瓊脂粉：5000mg/L；?

調(diào)整壯苗、生根培養(yǎng)基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋滅菌20分鐘；?