[發明專利]小麥花藥愈傷組織基因槍遺傳轉化方法

無效

• 申請號: 201010100814.4
• 申請日: 2010-01-22
• 公開（公告）號: CN101748152A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發明（設計）人: 陳耀鋒;史勇;陳鑫;李春蓮;任慧莉;崔志剛;權軍利;白延紅
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;A01H4/00;A01H1/08
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 李鄭建

1.一種小麥花藥愈傷組織基因槍遺傳轉化方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）小麥花藥愈傷組織誘導：選取小麥花粉細胞發育至單核中期到單核晚期的小麥幼穗，在2℃～4℃條件下低溫放置2天；

低溫放置后的小麥幼穗經常規消毒后，剝取花藥組織接種在花藥愈傷組織誘導培養基上，于25℃～27℃條件下遮光培養誘導小麥花藥愈傷組織；

所述的小麥花藥愈傷組織誘導培養基以通用培養基W14為基準，添加以下物質：2，4-二氯苯氧乙酸：2.0?mg/L，酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，蔗糖：100000mg/L，瓊脂粉：5000mg/L；

調整花藥愈傷組織誘導培養基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋滅菌20分鐘；

2）高滲培養：小麥花藥組織誘導培養40天后陸續產生花藥愈傷組織，分批挑選小米粒大小、顏色、質地一致的花藥愈傷組織轉移到高滲培養基中培養5h；所述的高滲培養基為愈傷組織誘導培養基再附加0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇；

3）基因槍轟擊轉化：經高滲培養后的花藥愈傷組織用常規的基因槍轉化方法進行轟擊轉化，基因槍轟擊參數為：金粉直徑1.0μm，阻擋網與轟擊材料之間的距離為6.0cm，可裂膜壓力為1100Pa，每槍金粉/DNA用量為1μg?/60μg，每皿材料轟擊1次；

4）恢復培養：基因槍轟擊后的花藥愈傷組織在上述高滲培養基上繼續培養8h，然后轉移到小麥花藥愈傷組織誘導培養基上恢復培養6h；

5）分化篩選培養：恢復培養6h后的花藥愈傷組織轉至分化篩選培養基上進行光照分化篩選培養；培養溫度為25～28℃，光照度3000?lx，每天光照12h；

所述的分化篩選培養基以通用培養基W14為基準，添加以下物質：6－呋喃基氨基嘌呤：2.0mg/L，α－奈乙酸：0.1mg/L，酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，蔗糖：30000mg/L，瓊脂粉：5000mg/L；

調整分化篩選培養基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋滅菌20分鐘；經基因槍轟擊、恢復生長的花藥愈傷組織在分化篩選培養基上分化出芽苗；

6）壯苗、生根培養：待花藥愈傷組織分化的芽苗長至2～3片葉時轉移到生根、壯苗培養基上，于25℃、3000Lx光照條件下進行壯苗、生根培養；

所述的壯苗、生根培養基以通用培養基W14為基準，并將W14通用培養的無機鹽濃度降低一半，添加α－奈乙酸：0.5mg/L，蔗糖：30000mg/L，瓊脂粉：5000mg/L；

調整壯苗、生根培養基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋滅菌20分鐘；

7）染色體加倍：在壯苗、生根培養基上根、苗生長健壯的花粉植株及時移栽到營養缽中，于15℃、1500Lx光照條件下緩苗，待完全緩苗且進一步生長10天后，用含0.05%的秋水仙素和1.5%的二甲基亞砜的染色體加倍液注射分蘗節，對花粉植株進行染色體加倍，注射在清晨8～10時進行，共3次，每隔一天注射1次，每次用量25μL，花粉植株經染色體加倍后得到加倍純合個體；

8）分子檢測并篩選：用常規的分子檢測技術對加倍純合個體進行分子檢測，篩選穩定的轉基因純合株。