[發明專利]一種促進10-羥基喜樹堿生物合成的方法

無效

• 申請號: 201010010120.1
• 申請日: 2010-01-18
• 公開（公告）號: CN102127582A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發明（設計）人: 趙榮國
• 申請（專利權）人: 趙榮國
• 主分類號: C12P39/00
• 分類號: C12P39/00;C12P17/18;C12R1/685;C12R1/785
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1.一種促進10-羥基喜樹堿生物合成的方法，其特征在于該方法如下：

(1)喜樹植物的葉在含激素的MS培養基上誘導愈傷組織；

(2)愈傷組織在含激素的MS培養基上繼代培養以獲得細胞培養系；

(3)喜樹細胞懸浮培養使用的液體培養基為含激素的MS培養基；

(4)在喜樹細胞懸浮培養液中加入硝酸鈷2～200μMol/L、硝酸鑭2～500μMol/L和水楊酸0.05～10mg/L；

(5)在喜樹細胞培養后期接種刺囊毛霉(Mucor?spinosus)和黑曲霉(Aspergillus.niger)進行生物轉化；

(6)喜樹細胞培養物與乙醇溶液進行勻漿處理并濾過，得到含有10-羥基喜樹堿的濾液；

其中在步驟(1)、(2)、(3)中使用的激素為6-芐基腺嘌呤和2，4-二氯苯氧乙酸，它們聯合使用，用量分別為0.1～2.5mg/L。

2.根據權利要求1所述的方法，喜樹細胞懸浮培養的條件是：在MS培養基中含有0.1～2.5mg/L?6-芐基腺嘌呤和0.2～1.2mg/L?2，4-二氯苯氧乙酸的激素組合，pH值為4.5～7.5；接種量為8～15％(W/V，g/ml)；培養溫度為20～35℃，通氣量為0.1～0.8L/min，培養時間為16～25天。

3.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(4)中硝酸鈷和硝酸鑭的添加時間分別在細胞懸浮培養的第1～5天；水楊酸的添加時間為細胞懸浮培養的第5～20天。

4.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(5)中生物轉化的條件是：在喜樹細胞培養期的第5～25天接種5～20％(W/V，g/ml)的刺囊毛霉(Mucor?spinosus)，1～100小時后接種1～20％(W/V，g/ml)的黑曲霉(Aspergillus.niger)；初始PH值為4.5～7.5，通氣量為0.1～1.0L/min，培養溫度為25～35℃，在接種黑曲霉(Aspergillus.nigr)后再培養轉化1～360小時。

5.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(6)中乙醇溶液的濃度為40～95％(V/V)，乙醇溶液的加入量為喜樹細胞培養物鮮重的2～15倍。