[發明專利]一種促進10-羥基喜樹堿生物合成的方法

無效

• 申請號: 201010010120.1
• 申請日: 2010-01-18
• 公開（公告）號: CN102127582A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發明（設計）人: 趙榮國
• 申請（專利權）人: 趙榮國
• 主分類號: C12P39/00
• 分類號: C12P39/00;C12P17/18;C12R1/685;C12R1/785
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域。具體涉及一種促進10-羥基喜樹堿生物合成的方法。

背景技術

10-羥基喜樹堿為我國特有珙桐科植物喜樹(Camptotheca?acuminala?Decne)中含有的一種痕量生物堿，它以DNA拓撲異構酶I為作用靶點，通過抑制生物體DNA的合成而發揮抗腫瘤作用。它不僅本身是臨床效果較好的抗腫瘤藥物，而且還是制備拓普替康(Topotecan)和伊立替康(Irinotecan)等其它喜樹堿類衍生物藥品的重要中間體；它在臨床上顯示出廣泛的抗腫瘤活性，并且毒副作用相對較小，國內的臨床需求量和出口量逐年增加。長期以來我國企業一直是從喜樹植物中直接提取，但因其含量低(約0.002％)，生產成本高，難以滿足臨床需要。因此，10-羥基喜樹堿的制備研究愈來愈多地受到重視，它已成為除紫杉醇類以外的植物類抗腫瘤藥物研究的第二大熱點。目前，對10-羥基喜樹堿的制備研究包括化學全合成、化學半合成、生物轉化和在近緣植物中尋找新的藥源等，但因種種原因，這些方法仍未用于工業化大生產。

發明內容

本發明人在開展懸浮培養喜樹細胞制備10-羥基喜樹堿的研究中，發現懸浮培養的喜樹細胞通過添加某些外源性物質進行次生代謝調控和接種某些微生物進行生物轉化后，喜樹細胞培養物中10-羥基喜樹堿的含量得到大幅度的提升。因此，針對提高10-羥基喜樹堿得率的喜樹細胞次生代謝調控方法和微生物轉化方法等方面進行了系統的研究，為建立促進10-羥基喜樹堿的生物合成方法及產業化奠定了基礎。

本發明的目的在于提供一種促進10-羥基喜樹堿生物合成的方法，通過添加外源性物質對懸浮培養喜樹細胞的次生代謝進行調控和接種微生物對培養后期的喜樹細胞進行生物轉化從而提高10-羥基喜樹堿的生產得率。

本發明采用的技術方案是：一種促進10-羥基喜樹堿生物合成的方法，其特征在于該方法如下：

(1)喜樹植物的葉在含激素的MS培養基上誘導愈傷組織；

(2)愈傷組織在含激素的MS培養基上繼代培養以獲得細胞培養系；

(3)喜樹細胞懸浮培養使用的液體培養基為含激素的MS培養基；

(4)在喜樹細胞懸浮培養液中加入硝酸鈷2～200μMol/L、硝酸鑭2～500μMol/L和水楊酸0.05～10mg/L；

(5)在喜樹細胞培養后期接種刺囊毛霉(Mucor?spinosus)和黑曲霉(Aspergillus.niger)進行生物轉化；

(6)喜樹細胞培養物與乙醇溶液進行勻漿處理并濾過，得到含有10-羥基喜樹堿的濾液；

其中在步驟(1)、(2)、(3)中使用的激素為2，4-二氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤，它們聯合使用，用量分別為0.1～2.5mg/L。具體地，其步驟如下：

1、喜樹細胞培養系的建立：

A、外植體的獲得：

取喜樹植物的葉，使用清水清潔干凈，浸入60～85％乙醇溶液中漂洗2～6min，然后用清水沖洗2～6次，再放置于滴加了2～10滴吐溫-80的0.1～2％次氯酸鈉溶液中浸泡1～30min；取出后使用無菌水沖洗至無泡沫，截成1～20mm長的小段。

B、喜樹愈傷組織的誘導和繼代培養：

喜樹愈傷組織的誘導和繼代培養是在光照培養箱中進行的。將A步獲得的外植體接入固體培養基中，光照11～20小時/天，培養溫度為20～35℃，培養11～30天，喜樹愈傷組織每隔3～7周繼代一次，繼代2～6次。

作為誘導、繼代培養喜樹愈傷組織的固體培養基，其基本培養基為MS培養基，其中附加了0.1～2.5mg/L?6-芐基腺嘌呤，0.2～40g/L蔗糖，0.2～10g/L尿素，0.2～1.2mg/L?2，4-二氯苯氧乙酸，凝固劑為瓊脂0.1～6g/L，pH為4.5～7.5。

C、喜樹細胞培養懸浮系建立：

將B步培養好的喜樹愈傷組織轉入通氣量為0.1～0.8L/min的氣升式內環流反應器中培養10～15天，溫度為20～35℃。

進行懸浮培養的液體培養基，其基本培養基為MS培養基，其中附加0.1～2.5mg/L?6-芐基腺嘌呤，0.2～40g/L蔗糖，0.2～10g/L尿素，0.2～1.2mg/L?2，4-二氯苯氧乙酸，pH為4.5～7.5。

2、添加外源性物質進行懸浮培養喜樹細胞次生代謝調控：