[發明專利]由人類多能干細胞產生間充質干細胞的方法以及通過所述方法產生的間充質干細胞

在審

• 申請號: 200980163164.3
• 申請日: 2009-10-28
• 公開（公告）號: CN102686724A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 金孝洙;姜炫在;李銀珠;樸永培
• 申請（專利權）人: 財團法人首爾大學校產學協力團
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/02;A61K35/48
• 代理公司: 北京同立鈞成知識產權代理有限公司 11205
• 代理人: 臧建明

技術領域

本發明涉及一種由人類多能干細胞誘導間充質干細胞的方法、通過所述方法產生的間充質干細胞以及包含間充質干細胞的細胞治療產品。

背景技術

干細胞是能夠分化為構成有機體組織的多種細胞的細胞，且一般指分化之前的未分化細胞，其可獲自胚胎、胎兒和成人身體的各個組織。干細胞通過分化刺激(環境)分化為特定細胞；與因分化完成而引起其細胞分裂已停止的細胞不同，干細胞允許通過經由細胞分裂(自我更新)產生與其本身相同的細胞來進行增殖(擴增)；且由于在不同環境下或通過不同的分化刺激，干細胞可分化為其它細胞，因此干細胞在分化過程中具有可塑性。

干細胞根據其分化能力可分為多能(pluripotent)、多效(multipotent)和單能(unipotent)干細胞。多能干細胞為具備全能性以分化為所有細胞的多能細胞，且這些多能干細胞包含胚胎干細胞(ES細胞)以及誘導性多能干細胞(iPS細胞)等。成體干細胞可為多效和/或單能干細胞的實例。

胚胎干細胞由早期胚胎發育中胚細胞的內細胞團形成；具備全能性以分化為所有細胞從而使得其能夠分化為任何種類的組織細胞；可以永生和未分化狀態的形式培養；與成體干細胞不同，可通過生殖細胞的制備遺傳到下一代(湯姆遜(Thomson)等人，科學(Science)，282，1145-1147，1998；瑞比諾夫(Reubinoff)等人，自然生物技術(Nat，Biotechnol.)，18；399-404，2000)。

通過在人類胚胎形成的時候僅分離并培養內細胞團來制備人類胚胎干細胞，且當前，已從滅菌操作后剩余的冷凍胚胎中獲得全局制備的人類胚胎干細胞。為使用能夠分化為所有細胞的多能人類胚胎干細胞作為細胞治療產品，已進行了各種嘗試；然而，這些嘗試尚未完全克服例如致癌和免疫排斥風險等高障礙。

作為對這些嘗試的一種補充，最近已對誘導性多能干(iPS)細胞進行了報道。包含在多能干細胞概念中的iPS細胞為通過去分化成體細胞獲得的細胞，所述成體細胞的分化以若干方式結束，因而在分化的早期階段恢復為胚胎樣狀態。到目前為止，已有報道稱鑒于基因表達和分化能力，去分化的細胞呈現出與胚胎干細胞(其為多能干細胞)幾乎相同的特性。這些iPS細胞還可使用自體細胞，因而排除了免疫排斥的風險，然而腫瘤發生的風險仍然是需要解決的問題。

近來，已提供了具有免疫調節功能并且無腫瘤發生風險的間充質干細胞作為用于解決這些問題的替代方法。間充質干細胞為能夠分化為脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、神經細胞、心肌細胞等的多效細胞，且已報道具有調節免疫反應的功能。間充質干細胞可從各種組織分離出來并培養，但它們的能力和細胞表面標記依據其來源而互不相同。因此，并不容易清楚地界定間充質干細胞。然而，間充質干細胞通常由可分化為骨細胞、軟骨細胞和肌細胞的細胞界定；具有螺旋形式；并且表達CD73(+)、CD105(+)、CD34(-)和CD45(-)，這些是基本的細胞表面標記。

同時，為使間充質干細胞用作細胞治療產品，再生醫學和/或細胞治療領域所需的約1×10⁹最少數量的細胞需得到滿足。然而，在考慮用于設定條件和標準的實驗時，實際需要的細胞數量進一步增加。因此，體外實驗中需要至少10次傳代以由獲自各種來源的現有間充質干細胞提供所述量的細胞。在這種情況下，細胞變得老化并經修飾，因此，它們可能不會再適于用作細胞治療產品。雖然已通過使用這些細胞來設定條件和標準，但可能會出現一些問題：這些細胞可能在實際用于治療中之前就已變得枯竭，從而需要使用來自他人的間充質干細胞，且在這種情況下，由于使用不同的細胞而需要進行額外的實驗。

解決現有間充質干細胞培養系統的上述問題的最理想替代方法是使用人類多能干細胞來產生間充質干細胞。然而，到目前為止，誘導人類多能干細胞分化為間充質干細胞已需要由特定細胞因子(例如，BMP、bFGF)進行誘導程序(這成本很高且需要控制濃度)或對具有異種病原體風險的異種飼養細胞(OP9小鼠細胞株)進行誘導程序以及其后通過特定標記(例如CD73)進行分選。

此外，就通過這些方法產生的間充質干細胞來說，很難維持其基本狀態且生產效率不高。此外，具有不同遺傳背景的人類多能干細胞具有不同的生理機制，從而無法使用用于誘導間充質干細胞分化的現有方法(這些方法先前是在特定系中建立)。因此，為從具有不同遺傳起源的人類多能干細胞誘導間充質干細胞具有一定的難度，需要開發和應用其它的分化誘導方法。鑒于這些原因，在再生醫學和細胞治療領域中，間充質干細胞在用作理想細胞治療產品時具有局限性。