[發明專利]新的鋅指核酸酶及其用途

無效

• 申請號: 200980157619.0
• 申請日: 2009-09-18
• 公開（公告）號: CN102333864A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 金晉秀;金惠周
• 申請（專利權）人: 圖爾金株式會社
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

技術領域

本發明涉及用于靶向切割和改變基因組序列、靶向切割后在外源多核苷酸和基因組序列之間發生同源重組，或者靶向切割后發生非同源性末端連接的方法和組合物。

背景技術

限制性酶是基因工程和分子生物學中不可或缺的工具。致力于創造識別并切割9個或更多個堿基對(bp)的特定DNA序列的、被稱為“稀有切點酶(rare?cutter)”的新的限制性酶。其中，鋅指核酸酶技術的作用為利用限制性酶來識別并切割多種DNA堿基序列，該限制性酶是由鋅指DNA-識別結構域和DNA-切割結構域組成的嵌合核酸酶。鋅指核酸酶可用來在在哺乳動物、植物或其它生物中進行有效的遺傳修飾，這是因為當將這種酶導入細胞中時，它能在基因組DNA中產生定向的雙鏈斷裂(DSB)。當細胞發生雙鏈斷裂時，受損的區域由細胞的自我修復系統進行修復。此時，將與受損區域具有相似DNA序列的供體DNA導入細胞中，能導致受損DNA和供體模板之間發生同源重組(HR)。為了對基因組的特定位點進行所需的修飾，將靶堿基序列并入供體DNA中。同時，在不存在供體DNA的情況下，受損細胞可以通過非同源性末端連接(NHEJ)來修復。非同源性末端連接(NHEJ)通過將兩個斷裂末端連接到一起來修復受損的DNA，并且通常不會產生突變。然而，在某些情況下，修復易于出錯，導致斷裂的DNA末端處發生堿基對的插入或缺失。總的來說，由鋅指核酸酶導致的特定堿基序列的雙鏈斷裂引起非同源性末端連接，因此所得的DNA含有突變，進而產生敲除細胞系。

真核生物基因組所編碼的最豐富的DNA-結合基序——鋅指(ZF)，提供了可能是最好理解的蛋白質-DNA結合機制中的一種(Wolfe，S.A.et?al.，(2000)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.，29，183-212；Pabo，C.O.et?al.，(2001)Annu.Rev.Biochem.，70，313-340；Moore，M.et?al.，(2003)BriefFunct.Genomic.Proteomic.，1，342-355和Klug，A.et?al.，(2005)FEBS?Lett.，579，892-894)。工程鋅指蛋白(ZFP)極可能作為基因調控和基因組修飾的工具，因為它們可以用于靶向幾乎在任何基因組的任何期望位置的功能性結構域。鋅指蛋白為設計具有新DNA-結合特異性的蛋白質提供了通用框架，這是由于它們具有模塊結構特征，并且當識別DNA堿基序列時，在堿基與氨基酸殘基之間具有堿基特異的相互作用。