[發(fā)明專(zhuān)利]新的鋅指核酸酶及其用途

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200980157619.0
• 申請(qǐng)日: 2009-09-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102333864A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金晉秀;金惠周
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 圖爾金株式會(huì)社
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/22
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/22
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11204
• 代理人: 王達(dá)佐;洪欣

1.融合蛋白鋅指核酸酶，其包含鋅指結(jié)構(gòu)域和核苷酸切割結(jié)構(gòu)域，其中所述鋅指結(jié)構(gòu)域包含三個(gè)或更多個(gè)鋅指模塊，

兩個(gè)或更多個(gè)所述鋅指模塊來(lái)源于天然存在的、野生型的鋅指模塊，和

所述融合蛋白識(shí)別并切割細(xì)胞染色質(zhì)中包含目的區(qū)域的核苷酸序列。

2.如權(quán)利要求1所述的鋅指核酸酶，其中所述鋅指結(jié)構(gòu)域包含三個(gè)或四個(gè)鋅指模塊。

3.如權(quán)利要求1所述的鋅指核酸酶，其中所述鋅指模塊是圖1所描述的模塊中的任何一個(gè)。

4.如權(quán)利要求1所述的鋅指核酸酶，其中所述鋅指核酸酶以二聚體的形式發(fā)揮切割核苷酸序列的作用。

5.如權(quán)利要求4所述的鋅指核酸酶，其中所述鋅指核酸酶是表2所描述的核酸酶中的任何一個(gè)。

6.如權(quán)利要求1所述的鋅指核酸酶，其中所述核苷酸切割結(jié)構(gòu)域是IIS型限制性?xún)?nèi)切核酸酶。

7.如權(quán)利要求6所述的鋅指核酸酶，其中所述IIS型限制性?xún)?nèi)切核酸酶是FokI。

8.用于切割、替換或修飾靶區(qū)域中的核苷酸序列的試劑盒，包含一對(duì)或多對(duì)權(quán)利要求1所述的鋅指核酸酶。

9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中所述鋅指核酸酶對(duì)是相同或不同的鋅指結(jié)構(gòu)域。

10.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，所述鋅指模塊是圖1所描述的模塊中的任何一個(gè)。

11.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中所述鋅指核酸酶對(duì)是表2所描述的核酸酶中的任何一個(gè)。

12.如權(quán)利要求11所述的試劑盒，其中所述核苷酸切割結(jié)構(gòu)域是IIS型限制性?xún)?nèi)切核酸酶。

13.如權(quán)利要求12所述的試劑盒，其中所述IIS型限制性?xún)?nèi)切核酸酶是FokI。

14.產(chǎn)生鋅指核酸酶的方法，包括以下步驟：

(a)選擇目的區(qū)域中的核苷酸序列；

(b)選擇與所述序列結(jié)合的鋅指模塊并工程改造鋅指結(jié)構(gòu)域，其中所述鋅指結(jié)構(gòu)域包含三個(gè)或更多個(gè)鋅指模塊，兩個(gè)或更多個(gè)所述鋅指模塊來(lái)源于天然存在的、野生型的鋅指模塊；以及

(c)表達(dá)包含鋅指結(jié)構(gòu)域和核苷酸切割結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。

15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述鋅指結(jié)構(gòu)域包含三個(gè)或四個(gè)鋅指模塊。

16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述鋅指模塊是圖1所描述的模塊中的任何一個(gè)。

17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述鋅指核酸酶以二聚體的形式發(fā)揮切割核苷酸序列的作用。

18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述鋅指核酸酶對(duì)是表2所描述的核酸酶中的任何一個(gè)。

19.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述核苷酸切割結(jié)構(gòu)域是IIS型限制性?xún)?nèi)切核酸酶。

20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述IIS型限制性?xún)?nèi)切核酸酶是FokI。

21.切割目的區(qū)域中的核苷酸的方法，包括以下步驟：

(a)選擇目的區(qū)域中的第一核苷酸序列；

(b)選擇與第一核苷酸序列結(jié)合的權(quán)利要求1的第一鋅指核酸酶；

(c)在包含所述核苷酸序列的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外表達(dá)所述第一鋅指核酸酶，從而將所述核酸酶導(dǎo)入所述細(xì)胞中；以及

(d)使所述第一鋅指核酸酶(其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或被導(dǎo)入細(xì)胞)與所述序列結(jié)合，以便切割目的區(qū)域中的細(xì)胞染色質(zhì)。

22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述第一鋅指核酸酶包含第一鋅指結(jié)構(gòu)域和第一核苷酸切割結(jié)構(gòu)域，

(e)在包含所述核苷酸序列的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外選擇并表達(dá)第二鋅指核酸酶，從而將所述核酸酶導(dǎo)入所述細(xì)胞中，其中所述第二鋅指核酸酶包含第二鋅指結(jié)構(gòu)域和第二核苷酸切割結(jié)構(gòu)域；以及

(f)使所述第二鋅指核酸酶(其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或被導(dǎo)入細(xì)胞)與所述目的區(qū)域中的第二核苷酸序列結(jié)合，其中所述第二序列與所述第一鋅指核酸酶所結(jié)合的所述第一核苷酸序列之間的距離為2-50個(gè)核苷酸。

23.如權(quán)利要求21或22所述的方法，其中所述切割在所述第一和第二核苷酸序列之間發(fā)生。