[發明專利]包含內切核酸酶活性的多肽片段及其用途

有效

• 申請號: 200980157310.1
• 申請日: 2009-12-18
• 公開（公告）號: CN102449144A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發明（設計）人: D·布維耶;T·克雷潘;R·呂格羅克;A·迪亞斯;S·庫薩克
• 申請（專利權）人: 歐洲分子生物學實驗室;約瑟夫傅立葉附屬大學;法國國家科學研究中心;產業政策部
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李進;郭文潔

發明的技術領域

本發明涉及包含具有內切核酸酶活性的病毒RNA依賴性RNA聚合酶的PA亞基的氨基端片段或其變體的多肽片段，其中所述PA亞基來源于屬于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)的病毒。本發明還涉及(i)適于應用X射線晶體分析法對所述多肽片段進行結構測定的多肽片段的晶體，和(ii)采用所述多肽的結構坐標篩選和設計調節、優選抑制多肽片段內的內切核酸活性部位(endonucleolytically?active?site)的化合物的計算方法。此外，本發明涉及優選在高通量背景下鑒定與具有內切核酸酶活性的PA多肽片段結合并且優選抑制所述內切核酸活性的化合物的方法。本發明還涉及用于治療由正黏病毒科病毒引起的病毒感染所致疾病的化合物和包含所鑒定的的化合物的藥物組合物。

發明背景

流行性感冒是造成全球發病率和死亡率極高的原因，被許多人認為屬于人類最嚴重的病毒威脅。每年盛行的流行性感冒橫掃全球，而且不時出現新的毒株造成巨大破壞力的廣泛流行。目前控制流感病毒流行的主要方法是接種疫苗。然而，突變型流感病毒快速產生，逃避接種疫苗的作用。根據產生一種新的流感疫苗需要大約6個月的事實，尤其需要替代性治療方法(即抗病毒療法)作為針對快速蔓延的大流行病的第一道防線。

開發抗病毒療法的極佳起點是必需的病毒蛋白的結構數據。因此，流感病毒表面抗原神經氨酸酶的晶體結構測定(von?Itzstein等，1993，Nature?363：418-423)直接導致了對具有防止病毒從細胞中釋放的抗病毒活性的神經氨酸酶抑制劑的開發，然而這并不能防止病毒產生。這些抑制劑及其衍生物隨后被開發成抗流感藥物扎那米韋(Glaxo)和奧塞米韋(Roche)，這些目前被許多國家大量貯備作為抵御可能發生的大流行的第一道防線。然而，這些藥物只供縮短臨床疾病的持續時間。或者，其它抗流感化合物(例如金剛烷胺和金剛乙胺)靶向病毒膜中的離子通道蛋白(即M2蛋白)，干擾細胞內病毒脫殼。然而，由于其副作用和抗性病毒突變株的快速發生而還未被廣泛采用(Magden等，2005，Appl.Microbiol.Biotechnol.66：612-621)。此外，研究表明更多的非特異性病毒藥物(例如利巴韋林)有效用作治療流感感染(Eriksson等，1977，Antimicrob.Agents?Chemother.11：946-951)。然而，可能由于其嚴重的副作用，因此利巴韋林只在少數國家獲準使用(Furuta等，2005，Antimicrob.Agents?Chemother.49：981-986)。顯然，需要新的優選針對不同靶標的抗病毒化合物。

甲型、乙型和丙型流感病毒和傳染性鮭魚貧血病毒(Isavirus)以及托高土病毒(Thogotovirus)屬于正黏病毒科，其連同布尼亞病毒科(Bunyaviridae)，包括漢坦病毒屬(Hantavirus)、納依羅病毒(Nairovirus)、正布尼亞病毒屬(Orthobunyavirus)、白蛉病毒(Phlebovirus)和番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)，是負鏈RNA病毒。它們的基因組是分段的，并進入包括RNA依賴性RNA聚合酶的核糖核蛋白顆粒，RNA依賴性RNA聚合酶進行：(i)將單鏈病毒粒RNA(vRNA)最初拷貝成病毒mRNA，和(ii)vRNA復制。對于病毒mRNA的產生，聚合酶利用所謂的“奪帽(cap-snatching)”機制(Plotch等，1981，Cell?23：847-858；Kukkonen等，2005，Arch.Virol.150：533-556；Leahy等，1997，J.Virol.71：8347-8351；Noah和Krug，2005，Adv.Virus?Res.65：121-145)。聚合酶由3個亞基組成：PB1(聚合酶堿性蛋白)、PB2和PA。對于奪帽機制，病毒聚合酶通過其PB2亞基與細胞mRNA分子的5’RNA帽結合，通過聚合酶的內切核酸活性在核苷酸10-13處切割細胞mRNA分子。加帽的RNA片段通過PB1亞基中的核苷酸轉移酶中心用作病毒mRNA合成的引物(Li等，2001，EMBO?J.20：2078-2086)。最后，通過聚合酶在模板5’端的寡U基序上時斷時續的移動，使病毒mRNA?3’端聚腺苷酸化。最新研究精確地定義了負責帽結合的PB2結構域(Fechter等，2003，J.Biol.Chem.278：20381-20388；Guilligay等，2008Nat.Struct.Mol.Biol.15：500-506)。聚合酶的內切核酸活性迄今一直被認為存在于PB1亞基上(Li等，同上)。