[發明專利]包含內切核酸酶活性的多肽片段及其用途

有效

• 申請號: 200980157310.1
• 申請日: 2009-12-18
• 公開（公告）號: CN102449144A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發明（設計）人: D·布維耶;T·克雷潘;R·呂格羅克;A·迪亞斯;S·庫薩克
• 申請（專利權）人: 歐洲分子生物學實驗室;約瑟夫傅立葉附屬大學;法國國家科學研究中心;產業政策部
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李進;郭文潔

1.一種多肽片段，所述多肽片段包含具有內切核酸酶活性的病毒RNA依賴性RNA聚合酶的PA亞基的氨基端片段，其中所述PA亞基來自屬于正黏病毒科的病毒。

2.權利要求1的多肽片段，所述多肽片段是可溶的。

3.權利要求1或2的多肽片段，所述多肽片段是可結晶的。

4.權利要求3的多肽片段，使用5-10mg/ml的20mM?Tris?pH?8.0、100mM?NaCl和2.5mM?MnCl₂的蛋白質溶液和由1.2M?Li₂SO₄、100mM?MES?pH?6.0、10mM乙酸鎂和3％乙二醇構成的貯存溶液可使所述多肽片段結晶。

5.權利要求1-4中任一項的多肽片段，其中所述PA亞基來源于甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒或者為其變體。

6.權利要求1-5中任一項的多肽片段，其中所述氨基端片段相當于甲型流感病毒RNA依賴性RNA聚合酶(SEQ?ID?NO：2)的所述PA亞基的至少1-196位氨基酸。

7.權利要求1-6中任一項的多肽片段，其中將所述多肽片段純化到適于結晶的程度。

8.權利要求1-7中任一項的多肽片段，其中2個二價陽離子與之結合，其中所述二價陽離子優選為錳。

9.權利要求1-8中任一項的多肽片段及其保持內切核酸酶活性的變體，其中

(i)N端等同于或相當于1位氨基酸，C端等同于或相當于選自SEQ?ID?NO：2的PA亞基的氨基酸序列的196-209位的氨基酸，

(ii)N端等同于或相當于1位氨基酸，C端等同于或相當于選自SEQ?ID?NO：4的PA亞基氨基酸序列的195-206位的氨基酸，或

(iii)其中N端等同于或相當于1位氨基酸，C端等同于或相當于選自SEQ?ID?NO：6的PA亞基氨基酸序列的178-189位的氨基酸。

10.權利要求1-9中任一項的多肽片段，所述多肽片段由SEQ?ID?NO：2所示氨基酸序列的1-209位氨基酸和任選具有氨基酸序列GMGSGMA(SEQ?ID?NO：19)的氨基端接頭組成且具有由圖18所示的結構坐標定義的結構。

11.權利要求1-10中任一項的多肽片段，其中所述多肽片段具有空間群為P43212，晶胞大小為a＝b＝6.71±0.2nm，c＝30.29nm±0.4nm的晶型。

12.權利要求10或11的多肽片段，其中所述晶體衍射X射線的分辨率為或更高、優選或更高。

13.一種編碼權利要求1-12中任一項的分離多肽的分離多核苷酸。

14.一種包含權利要求13的所述分離多核苷酸的重組載體。

15.一種包含權利要求13的所述分離多核苷酸或權利要求14的所述重組載體的重組宿主細胞。

16.一種方法，用于鑒定調節來自正黏病毒科的病毒RNA依賴性RNA聚合酶的PA亞基的內切核酸酶活性的化合物，所述方法包括以下步驟：

(a)構建活性部位的計算機模型，所述活性部位由圖18所示的權利要求10的多肽片段的結構坐標定義；

(b)通過選自以下的方法選擇潛在的調節化合物：

(i)將分子片段裝配成所述化合物，

(ii)從小分子數據庫選擇化合物，和

(iii)對所述化合物進行從頭配體設計；

(c)運用計算方法，進行所述化合物與所述活性部位的計算機模型之間的擬合程序運算，從而提供所述化合物在活性部位中的能量最低化構型；和

(d)評價所述擬合運算的結果以量化所述化合物與活性部位模型之間的關系，以此評價所述化合物與所述活性部位締合的能力。

17.權利要求16的方法，其中所述活性部位包含相當于SEQ?ID?NO：2的PA亞基的氨基酸Asp108、Ile120和Lys134的氨基酸。