[發明專利]用于單個DNA分子的直接測序的方法和系統

無效

• 申請號: 200980156620.1
• 申請日: 2009-12-11
• 公開（公告）號: CN102317471A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發明（設計）人: 黃曉華
• 申請（專利權）人: 加利福尼亞大學董事會
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/48;C12N15/10
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

相關申請的交叉引用

本申請要求于2008年12月11日提交的美國臨時申請第61/121,809號的優先權，通過引用將其全文并入本文。

發明背景

與利用Sanger雙脫氧測序方法的傳統的基于凝膠或毛細管的測序儀相比，通過大規模的平行化和小型化，DNA測序的處理能力已經大大提高了，而測序的成本卻降低了幾個數量級。數種出現的其它測序平臺可以有效地提高處理能力，并且甚至可以將DNA測序的成本再降低兩個數量級，有望為我們提供所謂的$1000基因組測序技術(Rothberg，J.M.and?Leamon，J.H.，Nat?Biotechnol，26；1117-1124(2008)；Schloss，JA.，Nat?Biotechnol，26：1113-1115(2008)；Shendure，J.and?Ji，H.，Nat?Biotechnol，26：1135-1145(2008))。

$1000基因組技術的可行性有望使基因組學走出主要的測序中心，并步入個體研究人員的實驗室。這將顯著改變生物醫學研究，使基因組、轉錄組、遺傳網絡等的綜合分析成為可能。盡管已經取得巨大進步，但是$1000基因組技術仍沒有被攻克。

在一系列綜述中報道了基因組測序技術發展中的最新進展和巨大挑戰(Rothberg，J.M.and?Leamon，J.H.，Nat?Biotechnol，26；1117-1124(2008)；Schloss，J.A.，Nat?Biotechnol，26：1113-1115(2008)；Branton，D.et?al.，Nat?Biotechnol，26：1146-1153(2008))。

本發明提供了用于遺傳物質測序的改進方法，例如，用于醫學應用和生物醫學研究。公開的方法可以用于快速個性化醫學、遺傳診斷、病原體鑒定和生物圈中任何物種的基因組測序。

發明概述

本發明提供了用于快速DNA測序的組合物、方法、試劑盒和系統。在某些實施方案中，將感應器設置到聚合酶分子的表面，用于監測伴隨每種堿基類型的并入而發生的細微的、但不同的構象改變。利用共振能量轉移(FRET)技術可以精確測定聚合酶1-10埃的移動。位于聚合酶上重要殘基處的多個FRET對(或網絡)可用來實時監測構象改變(比DNA合成速率快10倍)。感應器能提供關于聚合酶的動態結構的多個參數信息，這些信息隨后提供并入的每種堿基類型的特有識別。按照公開的方法，還能檢測到模板DNA上的化學修飾，例如甲基化。

因此，本發明提供了標記的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶包含至少一個FRET供體和至少一個FRET受體，其中所述FRET供體和FRET受體在DNA聚合酶上的位置能使得對于被DNA聚合酶并入新DNA鏈的每種不同核苷酸都會產生不同的FRET信號。所述FRET供體和受體在DNA聚合酶上的位置能使得當聚合酶將核苷酸添加到DNA新生鏈時，至少根據并入的堿基(A、C、G、T)而產生的不同的FRET信號。在某些實施方案中，當DNA聚合酶讀取(遇到)模板DNA上甲基化的核苷酸時，產生不同的FRET信號。

在某些實施方案中，FRET供體的位置距FRET受體的距離非常接近于半徑(R₀)。例如，當DNA聚合酶處于開放位置時，供體的位置距受體約1個半徑(R₀)或在例如10、5、2.5或1埃的半徑(R₀)內。在某些實施方案中，從DNA聚合酶的開放位置到關閉位置，FRET供體和FRET受體之間的距離改變至少1、2.5、5、10或更多埃。

在某些實施方案中，FRET供體和受體位于DNA聚合酶的溶劑可及表面上。在某些實施方案中，FRET供體和受體不干擾DNA聚合酶的活性。在某些實施方案中，FRET受體位于手指結構域上，例如位于手指結構域的溶劑可及表面上，并且FRET供體位于手掌或拇指結構域(或者在DNA合成過程中保持相對靜止的另一結構域)上，例如位于聚合酶的溶劑可及表面上。在某些實施方案中，FRET受體位于DNA聚合酶的拇指或手掌結構域(或者在DNA合成過程中保持相對靜止的另一結構域)上，例如位于溶劑可及表面上，同時FRET供體位于手指結構域上，例如位于手指結構域的溶劑可及表面上。