[發(fā)明專利]用于單個(gè)DNA分子的直接測(cè)序的方法和系統(tǒng)

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200980156620.1
• 申請(qǐng)日: 2009-12-11
• 公開（公告）號(hào): CN102317471A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃曉華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/48;C12N15/10
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11204
• 代理人: 王達(dá)佐;洪欣

1.標(biāo)記的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶包含至少一個(gè)FRET供體和至少一個(gè)FRET受體，其中所述FRET供體和FRET受體位于在DNA聚合酶上的位置能使得當(dāng)聚合酶將核苷酸添加到DNA新生鏈時(shí)，至少根據(jù)并入的堿基(A、C、G、T)而產(chǎn)生不同的FRET信號(hào)。

2.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，其中當(dāng)DNA聚合酶處于開放位置時(shí)，F(xiàn)RET供體距FRET受體為10埃以內(nèi)的半徑(R₀)。

3.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，其中從DNA聚合酶的開放位置到關(guān)閉位置，F(xiàn)RET供體和FRET受體之間的半徑改變至少2.5埃。

4.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，其中所述FRET供體和FRET受體與DNA聚合酶的溶劑可及表面上的氨基酸共價(jià)連接。

5.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶來(lái)自噬菌體或細(xì)菌。

6.如權(quán)利要求5所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，其中所述噬菌體是

7.如權(quán)利要求5所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌(E.coli)。

8.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶是經(jīng)基因工程化的。

9.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，還包含至少一個(gè)第二FRET供體。

10.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，還包含至少一個(gè)第二FRET受體。

11.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，還包含至少一個(gè)第二FRET供體和至少一個(gè)第二FRET受體。

12.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，其中所述FRET供體和FRET受體的位置能使得當(dāng)DNA聚合酶讀取模板DNA上甲基化的核苷酸時(shí)，產(chǎn)生不同的FRET信號(hào)。

13.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，其中按照包括以下步驟的方法制備所述DNA聚合酶：

選擇DNA聚合酶上的至少一個(gè)第一位置用于FRET供體標(biāo)記和DNA聚合酶上的至少一個(gè)第二位置用于FRET受體標(biāo)記；和

在每個(gè)所選的位置處引入非天然存在的氨基酸，從而制備標(biāo)記的DNA聚合酶。

14.制備權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶的方法，所述方法包括以下步驟：

選擇DNA聚合酶上的至少一個(gè)第一位置用于FRET供體標(biāo)記和DNA聚合酶上的至少一個(gè)第二位置用于FRET受體標(biāo)記；和

在每個(gè)所選的位置處引入非天然存在的氨基酸，從而制備標(biāo)記的DNA聚合酶。

15.如權(quán)利要求14所述的方法，所述第一位置處的非天然存在的氨基酸不同于所述第二位置處的非天然存在的氨基酸。

16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述非天然存在的氨基酸是標(biāo)記的氨基酸。

17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述非天然存在的氨基酸是取代的氨基酸。

18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述取代的氨基酸是半胱氨酸或賴氨酸。

19.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述引入步驟包括體外翻譯反應(yīng)。

20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述體外翻譯反應(yīng)包括以下步驟：

a)將包含編碼權(quán)利要求1所述的DNA聚合酶的序列的多核苷酸固定；

b)在適于翻譯的條件下，使所述固定的多核苷酸相繼與兩種或更多種不同的反應(yīng)混合物接觸；

c)在與每種不同的反應(yīng)混合物接觸的間隔，洗滌所述固定的多核苷酸；和

d)重復(fù)步驟c)和d)，直到翻譯出DNA聚合酶。