[發明專利]用于多肽重組表達的基于T7雙啟動子的載體系統

無效

• 申請號: 200980152893.9
• 申請日: 2009-10-29
• 公開（公告）號: CN102264905A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 張佑明
• 申請（專利權）人: 基因橋有限責任公司
• 主分類號: C12N15/73
• 分類號: C12N15/73
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 王旭

利用多種表達系統，可以在原核宿主系統中重組表達目的多肽。

在大腸桿菌(E.coli)中廣泛使用T7-表達系統。克隆靶基因，使其處于T7啟動子的控制之下，該T7啟動子由T7RNA聚合酶識別而不由大腸桿菌RNA聚合酶識別。T7RNA聚合酶是一種噬菌體-來源的聚合酶，其不內源存在于大腸桿菌中。然而，已經開發了表達T7RNA聚合酶的大腸桿菌宿主細胞。一個實例是包含攜帶編碼T7RNA聚合酶的基因的λ噬菌體的大腸桿菌¹。在另一種系統中，T7RNA聚合酶基因被插入到宿主大腸桿菌染色體(例如，大腸桿菌菌株BL21²)中。

通常使用處于可誘導的啟動子的控制下的pET表達系統。由lac操縱子調控的T7啟動子是目前最廣泛使用的可誘導的蛋白表達系統。在該系統中，T7啟動子和lac操縱子位于要表達的多肽的5’。lac抑制劑與lac操縱子的結合防止由T7啟動子轉錄。在存在乳糖類似物IPTG時，IPTG結合lac抑制劑并且使其從lac操縱子上脫離。因此，在存在IPTG的條件下，T7RNA聚合酶可以結合T7啟動子并且可以繼續轉錄目的基因。

不幸的是，lac/IPTG調控的系統僅能夠在某些大腸桿菌菌株(例如，在BL21中)使用。除大腸桿菌外多種原核細胞是適于重組多肽表達的宿主，例如，發光光桿狀菌(Photorhabdus?luminescens)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)，熒光假單胞菌(Pseudomonas?fluorencens)，豬霍亂沙門氏菌(Salmonella?choleraesuis)，胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia?carotovora)，根癌農桿菌(Agrobacterium?tumefaciens)和類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia?pseudomalleri)。具有也可以用在其它宿主細胞諸如這些中的用于重組多肽表達的高度調控性系統將是有效的。

當多肽對細胞是毒性的時，不管是由于其先天的特性還是由于其以大量存在的事實，在特定的原核宿主中生產某些多肽可能導致宿主死亡。

對原核宿主細胞有毒性的多肽的實例是抗微生物肽(“AMP(s)”)。由于其用作治療性抗生素的潛在用途，對抗微生物肽的興趣日益增多。常規抗生素已經成功地應用了大于一個世紀，并且廣泛地用于在人、動物和植物中的多種應用。盡管抗生素抗性是日益增加的問題，但是已經存在新抗生素開發的令人擔憂的下降。³⁴因此，禁止先前的抗生素的沒有限制的和非必要的應用，諸如其用作家畜的食品添加劑。另外，在農業中常用的多種抗生素對人類消費具有副作用。為了克服常規抗生素的問題，需要新一代的抗生素。

先天免疫性是幾乎所有活生物體的主要防御⁵，并且是針對微生物的快速且多功能性的防御。⁶⁷⁸大部分先天免疫性的抗微生物功能由小的陽離子肽介導，其具有針對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌、真菌、寄生蟲、病毒，且在某些情形中，甚至針對哺乳動物細胞的有效活性。⁹¹⁰¹¹這些天然產物AMPs是常規抗生素的潛在后繼者，因為其抗微生物機制基本上不同。¹²通過AMPs快速殺死微生物病原體的主要機制歸因于微生物細胞膜的穿孔。¹³¹⁴因此，生物很難建立抗性。

最有希望用于哺乳動物的AMPs是具有針對微生物而非哺乳動物細胞的強活性的那些AMPs。因此，動物來源的AMPs將是替代常規抗生素的良好候選物。來源于牛奶中的牛乳鐵蛋白(lactoferrin)的乳鐵蛋白素B(Lactoferricin?B)(LfcinB)¹⁵¹⁶¹⁷和來源于豬腸的天蠶素P1(cecropin?P1)¹⁸¹⁹是這些AMPs中的兩種，并且它們可以作為用于動物治療的備用抗生素。天然AMPs具有寬泛的針對微生物的活性，但是有一些，諸如LfcinB，需要高濃度才能有效。

AMPs的大規模應用是受限的，因為其制備可能是復雜的、費時的和成本高的。目前，通過化學合成生成AMPs成本太高以致它們不能用作用于動物(例如有蹄動物、豬、魚或人)治療的備用抗生素。因此，在它們可以替代大規模的抗生素應用之前，需要工業規模的成本有效的AMP生產方法。

因為AMPs可以穿透細菌膜并且引起細胞裂解，所以難以直接在細菌細胞中生產它們。因此，尚沒有實現便利的且成本有效的細菌生產。

因此，本發明的一個目的是提供一種用于多肽重組表達的系統，該系統可以在寬泛的宿主范圍中使用。