[發明專利]在樣品中檢測目標核酸的方法

無效

• 申請號: 200980151702.7
• 申請日: 2009-12-17
• 公開（公告）號: CN102257163A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: N.牛頓
• 申請（專利權）人: 霍夫曼－拉羅奇有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 權陸軍;郭文潔

發明領域

概括說來本發明涉及在樣品中檢測目標核酸的方法。更具體地說，本發明涉及使用熒光探針對在樣品中檢測目標核酸的方法，該熒光探針對包括可以用于雜交測定和核酸擴增反應，特別是聚合酶鏈式反應（PCR）的熒光報道分子以及猝滅劑分子。

發明背景

使用熒光探針監測核酸擴增反應，例如聚合酶鏈式反應（PCR）的方法是本領域已知的。

熒光探針的一個實例是如圖1中描述的熒光雙標記探針。?這樣的熒光雙標記探針一般由兩種不同染料，也就是報道分子和猝滅劑標記的寡核苷酸組成，能與特定的目標核酸序列雜交。報道分子是被光激發時能夠發射熒光的分子，而猝滅劑是能夠吸收報道分子發射的熒光的分子。有時候，報道分子位于寡核苷酸的5'末端而猝滅劑位于3'末端。對于這類熒光探針，當探針與目標核酸序列雜交或者它在PCR反應期間斷裂時發射熒光。PCR反應的監測基于當PCR反應進行時監測熒光隨時間的強度。更具體地說，當探針沒有與目標核酸序列雜交時它呈無規卷曲構象而報道分子在空間上足夠接近猝滅劑以致發生從報道分子到猝滅劑的F?rster型共振能量轉移（FRET）。在這種情況下，當報道分子被適當波長的光激發時，報道分子發射的熒光被猝滅劑猝滅而觀察到相對低的熒光強度。當探針與目標核酸序列雜交時，探針不再自身折疊，這樣報道分子和猝滅劑之間的距離增加。從而，FRET減少，報道分子發射的熒光較少地被猝滅劑猝滅而觀察到相對較高的熒光強度。如果在PCR的延伸階段期間探針被DNA聚合酶裂解，報道分子與探針隔斷，這樣在報道分子和猝滅劑之間沒有FRET發生。?于是，熒光強度也相對較高。該過程在PCR反應的每一循環中重復。由此監測熒光強度的變化可以用來定量地監測PCR反應。

有一些與熒光雙標記探針的使用相關的缺陷。特別是，當雙標記探針用于使用非裂解DNA聚合酶的PCR過程時，熒光信號變化的大小僅僅由染料附著的DNA探針的長度和構象控制。因為在雙標記探針的情況下，染料附著于相同的DNA片段，它們能夠離開彼此的距離是有限的。熒光雙標記探針的應用可能被該狀況限制。

通過使用雜交探針對，其中熒光染料在不同的寡核苷酸上，染料能夠彼此遠離，因此增加了熒光變化并產生更大的信號動力學。如圖2中示意地描述的，在熒光雜交探針對中，第一寡核苷酸用熒光供體染料標記而第二寡核苷酸用熒光受體染料標記。第一和第二寡核苷酸設計成能與一條目標核酸序列雜交以便當兩種寡核苷酸都與目標核酸序列雜交時供體和受體相鄰，或者接近。當供體染料被光激發時，它通過FRET將其全部或部分能量轉移給受體。因此受體發射的光能夠被檢測。相對較高的熒光強度顯示探針與目標核酸序列雜交。當在PCR反應的延伸階段期間探針被DNA聚合酶裂解時，供體和/或受體與探針隔斷并觀察到相對較低的熒光強度。

熒光雜交探針對的缺陷是當監測受體染料的熒光時觀察到熒光供體染料的高熒光背景。

由此需要使用熒光探針監測PCR反應的改進的方法，其中排除了高熒光背景并且甚至獲得更大的信號動力學。

發明概述

本發明提供了一種滿足該需要的使用熒光探針監測PCR反應的方法。

在第一方面中，本發明涉及一種在樣品中檢測目標核酸的方法，包括：

-??????????在第一和第二寡核苷酸探針與所述目標核酸選擇性雜交的條件下把所述樣品與基本上缺少5'-3'核酸酶活性的核酸聚合酶以及第一和第二寡核苷酸探針接觸，其中第一寡核苷酸探針包括熒光報道分子而第二寡核苷酸探針包括猝滅劑以便當第一和第二寡核苷酸探針與目標核酸雜交時熒光報道分子的熒光被猝滅劑猝滅，以及當第一和第二寡核苷酸沒有與目標核酸雜交時熒光報道分子的熒光不被猝滅劑猝滅，

-??????????用光源激發熒光報道分子，

-??????????在第一和第二寡核苷酸探針與目標核酸雜交的條件下監測熒光報道分子的熒光，并將該熒光與在第一和第二寡核苷酸探針沒有與目標核酸雜交的條件下獲得的熒光比較。

在另一個方面中，本發明涉及一種在樣品中檢測目標核酸的試劑盒，包括一對：

-??????????包括熒光報道分子的第一寡核苷酸探針，

-??????????包括猝滅劑的第二寡核苷酸探針，當第一和第二寡核苷酸探針與目標核酸雜交時該猝滅劑有效猝滅熒光報道分子的熒光，和

-??????????基本上缺少5'-3'核酸酶活性的核酸聚合酶。

在另一方面中，本發明涉及一種反應混合物，包括：

-??????????樣品中的目標核酸，