[發(fā)明專利]控制肺炎鏈球菌血清型19A多糖分子量的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980150879.5
• 申請日: 2009-12-17
• 公開（公告）號: CN102257155A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發(fā)明（設計）人: J·H·克林尼恩
• 申請（專利權(quán)）人: 惠氏有限責任公司
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 左路;林曉紅

發(fā)明領域

本發(fā)明涉及通過控制收獲時間來增加分離的肺炎鏈球菌(Strdptococcus?pneumoniae)血清型19A莢膜多糖的分子量的方法。

背景

在制備預防由肺炎鏈球菌(也稱作肺炎球菌)生物體導致的侵襲性疾病的多價綴合的肺炎球菌疫苗中，使選定的肺炎鏈球菌血清型生長以提供產(chǎn)生疫苗所需的多糖。細胞在發(fā)酵罐中生長，在發(fā)酵結(jié)束時通過加入脫氧膽酸鈉或者另外的裂解劑誘導裂解。然后收獲裂解物肉湯以進行下游的純化并回收圍繞細菌細胞的莢膜多糖。在與載體蛋白綴合后，所述多糖包含于最終的疫苗產(chǎn)物中，并賦予疫苗靶向群體對于選定的肺炎鏈球菌血清型的免疫力。

多糖大小是在每個批次制品中測定的質(zhì)量屬性，且必須適當控制。對于肺炎鏈球菌血清型19A多糖，多糖的大小受到例如發(fā)酵作用的pH、發(fā)酵溫度和保持溫度等參數(shù)的影響。此外，19A莢膜多糖在發(fā)酵/回收以及純化過程中均可出現(xiàn)熱降解，在擴大生產(chǎn)工藝以大規(guī)模制備19A莢膜多糖時，這對于成功處理和控制各種參數(shù)而言構(gòu)成另一個挑戰(zhàn)。

因此，需要從細胞肺炎鏈球菌裂解物中回收高分子量的血清型19A莢膜多糖的改良的方法。

發(fā)明簡述

本發(fā)明提供了從肺炎鏈球菌細胞裂解物中回收高分子量的血清型19A莢膜多糖的改良的方法。在一種方法中，將產(chǎn)生血清型19A莢膜多糖的肺炎鏈球菌細菌細胞的發(fā)酵培養(yǎng)物發(fā)酵，發(fā)酵時間少于6小時，然后裂解細菌細胞，并收獲莢膜多糖。因此，在本發(fā)明的一個實施方式中，所述方法包括如下步驟：1)制備產(chǎn)生血清型19A莢膜多糖的肺炎鏈球菌細菌細胞的發(fā)酵培養(yǎng)物；2)發(fā)酵所述發(fā)酵培養(yǎng)物，發(fā)酵時間少于6小時；3)裂解發(fā)酵培養(yǎng)物中的細菌細胞；以及4)從發(fā)酵培養(yǎng)物中分離肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖，由此產(chǎn)生含有高分子量的分離的肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖的溶液。在一個具體的實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)物的發(fā)酵時間少于5小時。在另一個具體的實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)物的發(fā)酵時間少于4小時。在另一個具體的實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)物的發(fā)酵時間在3小時到6小時之間。在另一個具體的實施方式中，分離的肺炎鏈球菌莢膜多糖的分子量為至少480kDa。

在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述方法還包括向產(chǎn)生肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖的細菌細胞培養(yǎng)物提供CO₂。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明的方法包括以下步驟：1)制備產(chǎn)生血清型19A莢膜多糖的肺炎鏈球菌細菌細胞的發(fā)酵培養(yǎng)物；2)向所述發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO₂；3)發(fā)酵所述發(fā)酵培養(yǎng)物，發(fā)酵時間少于6小時；4)裂解所述發(fā)酵培養(yǎng)物中的細菌細胞；以及5)從發(fā)酵培養(yǎng)物中分離肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖；由此產(chǎn)生含有高分子量的分離的肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖的溶液。在一具體的實施方式中，向發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO₂包括在發(fā)酵培養(yǎng)物中加入碳酸氫根離子(HCO₃^-)，例如在發(fā)酵培養(yǎng)物中加入NaHCO₃(碳酸氫鈉)。在進一步的實施方式中，向發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO₂包括在發(fā)酵培養(yǎng)物中加入碳酸根離子(CO₃^2-)，例如在發(fā)酵培養(yǎng)物中加入Na₂CO₃(碳酸鈉)。在另一實施方式中，向發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO₂包括首先加入NaHCO₃其次加入Na₂CO₃。在另一個實施方式中，向發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO₂包括用CO₂覆蓋發(fā)酵培養(yǎng)物。在另一實施方式中，分離的肺炎鏈球菌莢膜多糖的分子量為至少480kDa。

在另一實施方式中，本發(fā)明涉及含有高分子量的肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖的溶液，其中所述溶液通過如上所述的任一方法制備。

附圖簡述

圖1顯示了來自3L規(guī)模實驗室研究中的發(fā)酵期期間的光密度(OD)、堿和葡萄糖水平，其中使用Na₂CO₃作為滴定堿。為了繪圖目的，以克數(shù)表示的堿除以10。

圖2顯示了來自3L規(guī)模實驗室研究中的發(fā)酵期期間的光密度(OD)、堿和葡萄糖水平，其中使用NaOH作為滴定堿。為了繪圖目的，以克數(shù)表示的堿除以10。

圖3顯示了對于交替Na₂CO₃或NaOH補料在不同pH調(diào)節(jié)下的總蛋白質(zhì)和多糖結(jié)果。

圖4顯示了作為制備19A莢膜多糖過程中的發(fā)酵收獲時間的函數(shù)的分子量。