[發明專利]核酸定量的產品和方法

有效

• 申請號: 200980148025.3
• 申請日: 2009-11-20
• 公開（公告）號: CN102224259A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發明（設計）人: C·R·坎托
• 申請（專利權）人: 塞昆納姆股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 余穎

相關專利申請

本申請要求2008年11月24日提交的，題為“核酸定量產品和方法(NUCLEIC?ACID?QUANTIFICATION?PRODUCTS?AND?PROCESSES)”，發明人為C.R.坎托(Charles?R.Cantor)，代理人案卷號為SEQ-6021-PV的美國臨時專利申請第61/117,474號的優先權。上述專利申請的全部內容(包括所有文字、表格和附圖)通過引用納入本文。

技術領域

本技術部分涉及可用于核酸定量的產品和方法。

背景技術

核酸測序已經成為現代分子生物學的一種主要分析技術。用于測序的可靠方法的發展推動了對于遺傳信息組織的理解，并使遺傳材料的操作(即基因工程)成為可能。有多種方法用于核酸分子測序。歷史上，最常用的方法是基于化學(MG測序(Maxam?and?Gilbert?sequencing))或酶(Sanger雙脫氧測序和基于外切核酸酶的測序)反應，所述反應形成特定的截短核酸分子，然后通過電泳技術分離所述截短核酸分子以確定它們的相對長度。近來，已經開發出潛在的高通量技術，包括焦磷酸測序(pyro-sequencing)、納米孔測序(nanopore?sequencing)技術、基于雜交的測序技術、和基于非放射性技術在測序結果觀察中的應用。還提出可將掃描隧道顯微術用于直接觀察核酸分子的序列。

此外，采用多種核酸檢測技術，包括聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、基于核酸序列的擴增、鏈置換擴增、Q復制酶擴增和多種雜交技術檢測來自各種來源的不同豐度核酸的存在。一些策略將核酸檢測技術與核酸測序方法相結合。

發明概述

本發明提供生物樣品中目標核酸含量的定量方法，包括：(a)在目標與其對應物雜交的條件下，通過將(i)生物樣品的多種目標核酸(目標)與(ii)已知量的各目標的對應核酸(對應物)接觸來制備混合物，其中各對應物包含(i)與其目標基本相同的核苷酸序列和(ii)區分各對應物與其目標的特征；(b)壓縮目標在混合物中的動態范圍；(c)測定各目標和/或對應物的含量；以及(d)通過(c)中的含量定量分析各目標的含量。

本發明還提供鑒定生物樣品中目標核酸的方法，包括：(a)在目標與其對應物雜交的條件下，通過將(i)生物樣品的多種目標核酸(目標)與(ii)已知量的各目標的對應核酸(對應物)接觸來制備混合物，其中各對應物包含(i)與其目標基本相同的核苷酸序列和(ii)區分各對應物與其目標的特征；(b)壓縮目標在混合物中的動態范圍；以及(c)鑒定各目標和/或對應物。

本發明還提供壓縮生物樣品中目標核酸的動態范圍的方法，包括：(a)在目標與其對應物雜交的條件下，通過將(i)生物樣品中的多種目標核酸(目標)與(ii)已知量的各目標的對應物核酸(對應物)來接觸制備混合物，其中各對應物包含(i)與其目標基本相同的核苷酸序列和(ii)區分各對應物與其目標的特征；(b)將混合物與一組捕獲核酸接觸，其中(i)該組中的各捕獲核酸與一種目標和對應物特異性雜交，(ii)該組中的各捕獲核酸與其特異性雜交的目標和對應物的雜交強度基本相同，且(iii)各捕獲核酸的量低于生物樣品中目標的最高含量；從而目標的動態范圍得到壓縮。

上述方法中，在某些實施方式中在步驟(b)之前擴增目標及對應物，或在一些實施方式中在步驟(b)之后擴增目標及對應物。在某些實施方式中，對應物的特征是，在基本與目標相同的序列中存在單個核苷酸取代。在一些實施方式中，對應物的特征是，在基本與目標相同的序列上附加一個或多個額外核苷酸。在某些實施方式中，各目標的量與其對應物的量的比例在約1∶10到約10∶1之間。

在一些實施方式中，步驟(b)包括將混合物與一組捕獲劑接觸，其中：各捕獲劑特異性地捕獲各目標及其對應物，且各捕獲劑的含量在能夠壓縮混合物中目標的動態范圍的范圍內。在具體的實施方式中，捕獲劑的陣列位于固相載體上。在一些實施方式中，捕獲劑以基本相同的親和力與目標和對應物相互作用。在某些實施方式中，各捕獲劑是包含與目標的核苷酸序列互補的多核苷酸序列的捕獲核酸。

在一些實施方式中，目標-捕獲劑的解鏈溫度(Tm)與對應物-捕獲劑的Tm的差異低于或等于1攝氏度。在某些實施方式中，陣列的任何兩種捕獲劑的含量間相差低于或等于50％。