[發明專利]固定化基底及其制備方法

有效

• 申請號: 200980147877.0
• 申請日: 2009-12-04
• 公開（公告）號: CN102246041A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 南高一;都筑博彥;上田宏;伊原正喜
• 申請（專利權）人: 富士膠片株式會社;國立大學法人東京大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;C07K19/00;G01N33/547
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 陳平

技術領域

本發明涉及固定化基底和制備所述固定化基底的方法。

背景技術

諸如ELISA的免疫測定作為可以準確地檢測多種靶蛋白的系統是為人所熟知的。免疫測定使用蛋白和針對此蛋白的特異性抗體分別作為靶物質和檢測物質，并且基于這些物質之間的特異性相互作用以高靈敏度檢測所述靶物質。ELISA已經在靈敏度和可操作性方面進行了許多改進。近年來，一直需要在短時間內方便地和以高靈敏度地檢測大量樣品的測定方法。

分子印記技術是有效地利用靶物質和檢測物質之間的此特異性結合反應的另一種系統。

例如，已公開的日本專利申請(JP-A)No.2006-138656公開了一種分子印記凝膠，其通過使由引入靶分子的配體和所述靶分子的單體或聚合物構成的復合物與聚合物交聯劑反應以制備包含由所述配體和所述靶分子構成的復合物的凝膠，并從所述凝膠中去除所述靶分子而獲得。此外，JP-A?No.2006-138656公開了當將抗原AFP添加至包含抗AFP抗體和凝集素的凝膠基底時，由于AFP與抗AFP抗體和凝集素的結合導致凝膠收縮，并且通過凝膠的這種溶脹和收縮可以檢測AFP(靶分子)的存在。

然而，在上述分子印記法中，由于固定化基底通過聚合作用固定抗原-抗體復合物而形成，因此待檢測的抗原必須滲透至交聯的凝膠基質結構中以便接觸抗體。因此對于抗原與抗體反應需要一定時間，從而為了使物質確實地被識別，需要將高度濃縮的抗原與基底接觸2小時至4小時。此外，當抗原被洗掉和去除時，由于與上面相同的原因導致不能獲得有效的洗滌，因此去除后的反應性往往下降。因此，不能夠實現快速和高度靈敏的檢測。

除了上述技術以外，作為使用基于抗原-抗體反應的特異性結合的系統，利用兩種類型的熒光標記抗體片段之間的熒光共振能量轉移的免疫測定試劑被公開在JP-ANo.10-78436中。在此免疫測定試劑中，當缺少抗原時，不形成抗原-抗體復合物并且因此不發生熒光共振能量轉移(FRET)。另一方面，當存在抗原時，形成抗原-抗體復合物，并且因此發生FRET。因此，可以快速和簡單地檢測到抗原的存在。然而，在此試劑中，由于抗原和抗體片段不固定在基底上，所以抗原和抗體片段可以由于洗滌操作等而被洗掉或分散。因此，該試劑僅一次性使用，并且難以將該試劑用于重復使用。即使當這些抗體片段被簡單地固定在基底上以便重復地使用該試劑時，仍難以將發光物質和發光識別物質定位在基底上相鄰的位置中。當增加固定量以便使這些物質定位在相鄰的位置中時，大量的發光物質和發光識別物質相鄰地定位，這可以導致非常差的S/N比。

為了避免上述的問題，JP-A?No.2007-40834公開了一種方法，其中兩種抗體片段經接頭連接。在此方法中，盡管抗體片段可以固定在相鄰的位置中，但必須對每種抗體片段和抗原設計接頭使得兩種抗體可以有效地起作用。因此，此方法缺少通用性，因此增加了生產成本。

作為可以重復使用的簡單的檢測系統，JP-A?No.2008-83042公開了一種利用分子識別元件和納米粒子的可反復利用的生物傳感器。然而，由于必須設計接頭，所以此技術缺少通用性并且需要很多勞動。

此外，作為可以重復使用的簡單的檢測系統，日本分析化學學會第57界年會(2008)第97頁E3017的摘要公開了一種使用基底的檢測系統，在基底上固定有標記有疏水場-響應熒光物質的抗體。然而，在此系統中，在抗原識別時疏水場必須在抗原和抗體之間的界面處形成。因此，此系統僅限于抗原和抗體的特定組合，因此缺少通用性。另外，熒光物質需要在鄰近于抗體的抗原識別位點處標記，這需要高度復雜的設計。因此，此系統需要高成本和很多勞動。

發明內容

上述任一種技術均不足以作為以下用于檢測測試物質基底：該基底可以在短時間內準確和簡單地檢測靶分子并可以在洗滌后重復使用。

為了使用此基底用于生物傳感器，從生產成本的角度來看還需要具有更高通用性的制備方法。

本發明是在考慮到上述情況下完成的。本發明提供了一種固定化基底，其可以在短時間內準確和簡單地檢測靶分子并可以在洗滌后重復使用。

本發明還提供了可以有效地制備具有較高通用性的固定化基底的方法。

本發明包括下列方面：

<1>一種固定抗體片段的基底，包括基底和至少一組抗體片段，

其中每組抗體片段包括至少兩種類型的分開的抗體片段，