[發明專利]產生腺病毒載體的方法

有效

• 申請號: 200980143895.1
• 申請日: 2009-10-29
• 公開（公告）號: CN102203242A
• 公開（公告）日: 2011-09-28
• 發明（設計）人: A·魯伊琴斯;J·A·劉易斯
• 申請（專利權）人: 克魯塞爾荷蘭公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12M3/06;C12N15/861
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 左路;林曉紅

本發明涉及細胞培養和腺病毒生產領域。更具體地，本發明涉及培養哺乳動物細胞、用腺病毒感染這些細胞以及從中產生腺病毒顆粒的改良的方法。

背景技術

近年來在使用重組病毒載體的DNA免疫接種領域中的進展產生了大規模生產臨床級材料的需要。需要能支持欠發達和最不發達國家足夠量的重組基于腺病毒的疫苗以對抗肺結核和瘧疾問題的方法。出生組評估示出在2010-2015年在欠發達和最不發達地區預期有150,000,000以上的出生人口。基于這個出生組，預計每年需要的疫苗可達到大約1.5x10¹⁹病毒顆粒(VP)(http://esa.un.org/unpp/index.asp？panel＝2)。

已經描述了一些生產腺病毒的方法。這些方法使用在滾瓶、細胞工廠(Nunclon?from?Nunc?or?CellStack?from?Corning)或者Cell?Cubes(Corning)中的粘附細胞培養。粘附細胞培養的生產過程不能滿足基于腺病毒疫苗的世界范圍需要。因此，用于粘附方法中的細胞經改造適合懸浮培養(例如HEK293和PER.C6細胞系)。使用懸浮培養可以使生產方法至大規模生物反應器范圍。腺病毒生產的懸浮細胞培養通常在3-20L規模實現，有報道已經成功擴大至100L(Kamen?et?al.，2004)和250L(Xie?et?al.，2003)。報道了其中預期擴大至10,000L規模的實驗(Xie?et?al.，2003)。

然而，擴大至10,000L規模的主要缺點是高資金總額(CAPEX)，需要設計和建造10,000L的生物反應器設備。此外，在BSL?2條件下建造10,000L設備的CAPEX投入必須在甚至難以預料所述產物是否能成功之前實現(IV期及以外)。10,000L生物反應器設備的總投資費用在225,000,000至320,000,000之間(Estape?et?al.，2006)。因此，在較小規模如在1000L或者更小的生物反應器中制備是可取的。

使用現有的方法，在1000L規模必須一年生產超過150批次以達到1.5x10¹⁹VP/年的目標。因此，需要改良腺病毒生產系統，改良腺病毒顆粒的產量，以滿足腺病毒疫苗在世界范圍的需要，優選在非過高成本下滿足該需要。

腺病毒生產優化中遇到的一個問題是所謂的“細胞密度效應”。在分批模式操作中，一些參考文獻提示在腺病毒生產中存在感染時的最佳細胞密度。最佳密度在0.5-1x10⁶個細胞/mL之間(Maranga?et?al.，2005；Kamen?et?al.，2004)。在一批攪拌罐生物反應器中產生腺病毒(Ad5)示出，直至大約0.9x10⁶個細胞/mL時，每個細胞的病毒生產率仍保持恒定，但是在大約1x10⁶個細胞/mL時突然下降(Altaras?et?al.，2005)。超過2x10⁶個細胞/mL時，無感染性病毒顆粒可檢測出。產量隨感染的細胞密度而下降，與具體產量相關的斷點(breakpoint)是培養基依賴性的。迄今為止還沒有可商購的培養基示出具有支持病毒顆粒高產量同時保持在1x10⁶個細胞/mL以上的細胞密度特異性最佳生產的潛力(Kamen?et?al.，2004)。這種下降的原因還未知，但是可能是由于對于病毒生產的優先的養分有效性，或者由于對于病毒生產是抑制性的高代謝物濃度所致。

補料分批運行如添加葡萄糖、谷氨酰胺和氨基酸使得可以在直至2x10⁶個細胞/mL的細胞密度感染。然而，在高細胞密度實現的生產率低于在1x10⁶個細胞/mL的細胞密度進行感染獲得的那些生產率(Kamen?et?al.，2004)。

在灌注方法中，細胞通過中空纖維、旋轉過濾器(spin?filter)或者聲波分離器(acoustic?separators)被保留在生物反應器中，而培養基灌注在生物反應器中。在這些方法中，有時可達到＞100x10⁶個細胞/mL的細胞密度(例如Yallop?et?al.，2005)。