[發明專利]利用光譜分離，表征和/或標識微生物的方法

有效

• 申請號: 200980143430.6
• 申請日: 2009-10-30
• 公開（公告）號: CN102203588A
• 公開（公告）日: 2011-09-28
• 發明（設計）人: 約翰·沃爾什;瓊斯·海曼;瑟曼·索普;布拉德福德·克萊;克里斯多夫·羅恩斯克
• 申請（專利權）人: 生物梅里埃公司
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65;C12M1/12;C12M1/34;G01N21/64
• 代理公司: 北京市德恒律師事務所 11306
• 代理人: 陸鑫;高雪琴

相關申請的交叉引用

本發明要求享有2008年10月31日提交的題為“Method?and?System?for?Detection?and/or?Characterization?of?a?Biological?Particle?in?a?Sample”的美國臨時專利申請No.61/110,187的受益，其結合于本文中作為參考。

技術領域

本發明涉及檢測，分離和/或標識樣品中微生物的方法和系統.具體而言，本發明涉及利用光譜技術快速表征和/或標識微生物的方法。

背景技術

在生物學流體中檢測病原微生物，應該在盡可能最短的時間內完成，具體而言，在敗血病這種情況下，盡管對醫生而言可利用的抗生素譜很廣但是其死亡率仍然保持較高。生物學活性劑如微生物在患者體液尤其是血液中存在，采用血液培養瓶一般可以檢測。血流感染與高發病率和死亡率有關，然而當前的診斷方法，是采用培養之后進行生物化學標識并抗生素藥敏測試，這可能要進行幾天時間。典型地，基于臨床癥狀開始經驗療法，而當初始療法失效時測試結果僅僅影響臨床決策。在陽性血液培養結果之后在最初幾個小時，優選1個小時內表征血液感染的能力，將會顯著地加強提供的診斷信息的臨床定性。分子放大方法已經提出而填補了這方面的需要，但是對于這種方法仍保留有嚴重挑戰。陽性血液培養液自身代表天然放大的微生物種群，而潛在地適用于各種快速標識(ID測試。

傳統自動表型ID測試，如Vitek，Phoenix^TM和Microscan系統，或手動表型測試，如API，需要微生物處于合適的生長階段并無干涉介質和血液產物，才能提供強有力的結果。這些系統利用平板培養上的18～24h的陽性培養液的生長集落。然而，在努力獲得較快結果中，一些實驗室已經報道，采用了具有從陽性血液培養瓶分離的微生物的這些系統。這些來自培養瓶的直接測試并不適合于所有微生物(例如，革蘭氏陽性球菌)，通過測試廠商并未批準，而一般要花費3～8小時才能提供結果。較快而更廣泛的特異性測試是急需的，這才能在陽性培養結果之后為醫師在最初幾個小時優選1個小時內提供臨床相關結果。

光學光譜方法，如內源熒光(IF)、紅外光譜(FTIR)或拉曼光譜以及質譜方法如MALDI-TOF，具有容許非常快速地標識微生物的潛力，但是可能會遇到來自許多存在于液體微生物培養基和臨床樣品如血液或其組合中的高度熒光和吸收性化合物的干擾。直接從陽性血液培養液中回收微生物的最常用的方法是兩部差速離心和在血清分離器管中離心。

分離、表征和/或標識微生物的其它方法已經描述，包括：

美國專利No.4,847,198公開了一種利用UV激發拉曼光譜標識微生物的方法。根據′198專利，細菌懸浮液通過紫外光譜范圍內的單波長接觸。所用的部分光能被吸收而部分光能被發射。發射的光能，共振增強拉曼散射，作為反向散射能量進行測定。這種能量經過處理而產生細菌的特征光譜。

Vo-Dinh的美國專利No.5,938,617涉及一種通過用幾個波長的光激發樣品并同步取樣發射強度而標識樣品中生物學病原的系統。這種系統包括用于將樣品暴露于激發輻射并由此產生發射輻射的機制。生物學病原可能是病毒和細菌。

美國專利No.6,177,266公開了一種采用通過矩陣輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)分析細胞蛋白提取物或整個細胞而產生的屬、種和菌株特異性的生物標記而進行化學分類歸類細菌的方法。

在美國專利No.7,070,739中，提出了一種通過二維超離心直接從體液或均質化組織中提取、分離和純化包括病毒的微生物的方法。在第一個離心步驟中，所有沉降速度高于待標識微生物的沉降速率的粒子都被除去。在第二步超離心步驟中，采用特殊交替的離心管，于填充流體中應用等密度分帶而形成寬范圍的密度梯度。根據該專利，分離技術能夠用于利用核酸特異性染料通過光散射或熒光檢測分帶的粒子并按照非常小的體積回收分帶粒子，用于通過病毒蛋白子單元和完整病毒粒子的質譜以及核酸質量和通過嚴格酶產生的片段的質量兩種的熒光流量細胞計數測定而進行表征。