[發明專利]利用內部校正定量檢測RNA

無效

• 申請號: 200980142616.X
• 申請日: 2009-10-22
• 公開（公告）號: CN102203289A
• 公開（公告）日: 2011-09-28
• 發明（設計）人: F·納茲
• 申請（專利權）人: 恰根有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 余穎

發明技術領域

本發明屬于生物學與化學領域。具體說，本發明屬于分子生物學領域。更具體說，本發明屬于核酸定量與實時PCR領域。此外，本發明涉及經校正的靶核糖核酸定量檢測。

背景技術

核酸混合物中特定靶核糖核酸(本文中也稱特定RNAs)的定量檢測對分子生物學的許多應用，如基因表達分析、或核酸混合物中特定RNA的純化至關重要。在定量檢測方法中，需確定樣品中特定RNA的濃度和/或相對或絕對含量。具體說，對于基因表達分析，例如測定生物樣品中的mRNA水平，需要一種可重現和比較的方法。例如，不總是能獲得具有相當體積、核酸含量、細胞材料等的生物樣品。

此外，生物樣品中核酸檢測和定量的靈敏度和選擇性至關重要。為了更好地比較兩種或多種不同(生物學)樣品中特定RNA的含量或者比較一個樣品中兩種或多種不同特定RNA的含量，必須把特定RNA的含量按輸入核酸或輸入核酸中的特定種類為基準進行校正。例如，特定RNA的含量可以通過將這些含量與樣品中的內標或全部(即總)核酸量或樣品中特定種類核酸的含量相關聯而進行校正。

對于(生物學)樣品中核酸的常規定量，廣泛采用了定量(實時)PCR(qPCR)。對于RNA，具體是mRNA，本領域采用定量實時逆轉錄PCR(RT-qPCR)。已采用不同的方法對定量PCR方法得到的數據進行校正。將特定mRNA的含量按不同的參比基因，例如持家或保持基因如β-肌動蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、或者28S或18S核糖體RNA的一種或多種mRNA的含量進行校正就是其中一種方法。然而，已經發現這些校正基因的表達水平取決于實驗條件、樣品的制備和來源(如組織或細胞類型)而不同，因此它們不是輸入核酸的可靠指示。所以，通常需要在費力易錯的過程中測試各種不同的持家基因以鑒定在所研究的樣品之間沒有變化的那些基因。

其它方法有，例如，依靠DNA和/或RNA總量或如核糖體RNA(rRNA)總量進行的校正。由于生物細胞和樣品中核糖體RNA的含量同樣取決于多種因素而有差異，用rRNA校正也不太優選。本領域現有的依賴于按例如核酸總量、RNA總量或基因組DNA總量進行校正的方法也有局限性，如這些含量變化或核酸樣品的質量有所不同。用外來或人造分子如摻入樣品(如細胞抽提物或者組織衍生樣品)中的體外轉錄產物進行校正也不總是充分的方案，因為它們不能代表細胞內的核酸(如基因組DNA、RNA、mRNA)含量。

此外，為了比較經校正的數據以及實驗方案的重現性，需要對所用的實驗條件編制詳盡的文檔。當分別測定或用不同方法測定感興趣的核酸與校正核酸的含量時，這一點特別相關。

因此，本發明主要的技術問題是開發和提供一種改進的、特別是較不費力不易錯的方法來校正靶核糖核酸的含量。

發明概述

本發明涉及一種定量測定樣品中一種或多種靶核糖核酸的方法，包括以下步驟：

(i)提供包含所述一種或多種靶核糖核酸的樣品；

(ii)在允許所述染料與所述樣品中一種或多種核糖核酸結合的條件下，使所述樣品與核糖核酸特異性熒光染料接觸；

(iii)測定所述樣品中所述RNA-結合染料的熒光；

(iv)將所述測得的熒光與樣品中的RNA總量相關聯；

(v)逆轉錄所述一種或多種核糖核酸，從而產生雙鏈核酸；

(vi)擴增所述一種或多種產生的雙鏈核酸，其中在擴增期間和/或之后，在允許一種或多種探針與樣品中產生的所述一種或多種雙鏈核酸結合的條件下，存在所述一種或多種擴增產物的一種或多種特異性熒光探針；

(vii)測定擴增期間和/或之后結合于所述一種或多種擴增產物的所述一種或多種探針的熒光，并把所述測得的熒光與樣品中靶RNA序列的量相關聯；

(viii)按樣品中RNA的總量校正樣品中靶RNA序列的含量。

樣品至少含有需定量的核糖核酸的核酸分子。所述核酸可以包含在細胞或者生物體內，但也可以存在于無細胞系統中。樣品可以是液體、裂解液、固體基質或其它含有核酸分子的任何物質。在本發明中，樣品可以是所有生物組織和所有液體如淋巴液、尿液、腦液。組織可以是，例如上皮組織、結締組織如骨骼或血液、肌肉組織如內臟或平滑肌和骨骼肌，以及神經組織。在一種實施方式中，樣品是細胞培養物或細胞培養抽提物。