[發(fā)明專利]細(xì)胞保存方法和細(xì)胞運輸方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980142214.X
• 申請日: 2009-10-23
• 公開（公告）號: CN102203241B
• 公開（公告）日: 2017-05-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 一丁田洋子;田崎剛;福田始弘;鶴田仁志;谷口英樹
• 申請（專利權(quán)）人: 可樂麗股份有限公司;公立大學(xué)法人橫浜市立大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司72001
• 代理人: 孫秀武,高旭軼

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及保存活細(xì)胞的細(xì)胞保存方法和細(xì)胞運輸方法。

背景技術(shù)

將從組織分離出的細(xì)胞用于試驗、檢驗的方法，是生物技術(shù)相關(guān)領(lǐng)域中不可欠缺的方法。其廣泛用于疾病、病情的診斷、新藥的探索和藥效的判定、或者動物檢驗、植物檢驗、環(huán)境污染物質(zhì)的試驗等。因此，在生物技術(shù)領(lǐng)域中使用的細(xì)胞類別極其多樣化。

分離得到的細(xì)胞也有直接用于試驗的情況，但多數(shù)情況下是在培養(yǎng)皿或試管中進行細(xì)胞培養(yǎng)。使用該培養(yǎng)細(xì)胞，進行各種檢驗。對于用于細(xì)胞培養(yǎng)試驗的細(xì)胞培養(yǎng)株，要求其表現(xiàn)與在生物體內(nèi)的試驗、即所謂體內(nèi)（in vivo）試驗同樣的藥物感受性、毒性反應(yīng)。即，需要在細(xì)胞培養(yǎng)容器的表面能夠構(gòu)筑有規(guī)則性地排列的細(xì)胞間的網(wǎng)絡(luò)。另外，由于在細(xì)胞培養(yǎng)試驗中使用的細(xì)胞培養(yǎng)株極為昂貴，因此期望提高細(xì)胞的生存率和增殖速度。

上述細(xì)胞培養(yǎng)試驗是在同一條件下，以將評價的藥物等的量、濃度等為變量，測定其效果。因此，細(xì)胞培養(yǎng)容器的材質(zhì)、形狀等也需要相同。作為該細(xì)胞培養(yǎng)容器，一般使用塑料制平皿、玻璃制平皿、固定在容器內(nèi)的玻璃板、孔板等。孔板有6孔、12孔、48孔、96孔的各板或平皿。它們一般與整個板的大小幾乎相同，孔數(shù)越大，1個孔的尺寸越小。該1個孔相當(dāng)于1個培養(yǎng)皿。另外，由于最近的微量化的趨勢，因此也開始使用包含更小口徑且多量的培養(yǎng)皿的384孔板。這些培養(yǎng)皿的底部是平坦的平板狀，使用該底面作為培養(yǎng)面。

但是，在組織細(xì)胞的培養(yǎng)中，如果使用現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)容器，則細(xì)胞薄薄地鋪展，形成沒有方向性的形態(tài)。另外，由于在細(xì)胞培養(yǎng)容器的表面無規(guī)則地配置，因此細(xì)胞間的網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜地交織而形成。因此，存在不能重現(xiàn)在生物體內(nèi)的細(xì)胞功能的問題。例如，不能形成在肝細(xì)胞中維持肝功能的已知的球體狀的肝細(xì)胞團。

為了解決上述問題，公開了在平板狀的培養(yǎng)面將特殊的高分子固定化的方法(參考專利文獻1)、使用特殊的裝置的方法(參考專利文獻2)、在高分子凝膠中進行培養(yǎng)的方法(參考專利文獻3)等。

但是，在專利文獻1記載的方法中，存在固定化方法繁雜、不能穩(wěn)定地制造、且成本高的問題。另外，在專利文獻2記載的方法中，無論培養(yǎng)方法的復(fù)雜，仍存在細(xì)胞團的形成效率差，成本高等的問題。在專利文獻3的方法中，有不能控制細(xì)胞團的大小、另外基板的操作性繁雜等的問題。這樣，這些方法都繁雜，不能穩(wěn)定地制造，且成本高。

專利文獻1: 日本專利第3177610號公報

專利文獻2: 日本特開平7-79772號公報

專利文獻3: 日本特開平8-308562號公報。

發(fā)明內(nèi)容

從生物體分離的活細(xì)胞期望在與生物體同樣的環(huán)境下保存。例如，當(dāng)保存非冷凍的肝細(xì)胞時，在平面狀的培養(yǎng)板粘附肝細(xì)胞，裝滿培養(yǎng)基，置于保溫(例如25~37℃)狀態(tài)下進行保存。但是，當(dāng)在平面上培養(yǎng)細(xì)胞時，與生物體內(nèi)的環(huán)境大為不同，因此存在使細(xì)胞具有的原本的功能喪失的問題。另外，由于培養(yǎng)中或保存中的環(huán)境要素、例如振動、溫度、CO₂濃度(培養(yǎng)基的pH的變化)等，有細(xì)胞的功能進一步降低這樣的問題。

另外，如果用專利文獻1或?qū)＠墨I2公開的方法保存培養(yǎng)的細(xì)胞，則在發(fā)生振動等時，有由細(xì)胞的剝離或凝膠的損壞導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等的擔(dān)心。因此，難以在維持活細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)體的狀態(tài)下直接保存而運輸，難以在離開分離位置的位置利用。另一方面，從組織分離細(xì)胞的機制與進行試驗、檢驗的機制有許多不同，因而期望在不降低分離的細(xì)胞的功能的情況下進行保存、運輸。

本發(fā)明是為了解決這種問題而作出的發(fā)明，其目的在于提供在維持細(xì)胞功能的狀態(tài)下保存活細(xì)胞的細(xì)胞保存方法和細(xì)胞運輸方法。

本發(fā)明的細(xì)胞保存方法的一種方式是使用具有多個微空間的細(xì)胞培養(yǎng)容器來保存活細(xì)胞的細(xì)胞保存方法，使活細(xì)胞粘附在上述多個微空間的表面來進行培養(yǎng)，在上述培養(yǎng)后，將培養(yǎng)基向上述細(xì)胞培養(yǎng)容器注入，以覆蓋上述多個微空間，將上述細(xì)胞培養(yǎng)容器密封，以使培養(yǎng)基不漏出，進行保存。在微空間的表面粘附活細(xì)胞，使用適于培養(yǎng)的微空間進行培養(yǎng)，在各微容器內(nèi)形成三維結(jié)構(gòu)體，利用微容器隔離三維結(jié)構(gòu)體后，進行密封并保存，由此能夠以維持功能的狀態(tài)保存活細(xì)胞。

另外，上述細(xì)胞培養(yǎng)容器優(yōu)選保持在4℃以上且小于37℃的溫度、來保存上述活細(xì)胞。進一步地，優(yōu)選進行培養(yǎng)，以使粘附于上述表面、且在各微空間的空間內(nèi)形成的三維結(jié)構(gòu)體的細(xì)胞群體形成被隔離的細(xì)胞數(shù)。通過使用微空間，可以防止在各微空間培養(yǎng)的活細(xì)胞與其他微空間的活細(xì)胞接觸。