[發(fā)明專利]寡核苷酸檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200980141009.1
• 申請(qǐng)日: 2009-10-06
• 公開（公告）號(hào): CN102186993A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: I·羅爾;M·舒斯特;S·塞福爾特
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 弗·哈夫曼-拉羅切有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京市中咨律師事務(wù)所 11247
• 代理人: 胡志君;黃革生

本發(fā)明涉及檢測(cè)寡核苷酸的新的簡(jiǎn)單方法，所述的寡核苷酸包括RNA、DNA和混合寡核苷酸、反義寡核苷酸、短干擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、適體和鏡像體(spiegelmer)。此外，本發(fā)明涉及在單個(gè)測(cè)定中同時(shí)檢測(cè)雙鏈寡核苷酸兩條鏈的方法，例如用于siRNA。

已知序列的寡核苷酸普遍地用于各種化學(xué)和生物應(yīng)用中，并且在疾病的診斷和治療中起著重要的作用。具體地，反義寡核苷酸、短干擾RNA(siRNA)和適體是有希望的醫(yī)藥工具和治療劑。對(duì)例如細(xì)胞、組織或血漿等樣本中的這些寡核苷酸的定性和定量檢測(cè)是評(píng)估它們的治療用途以及監(jiān)測(cè)它們體內(nèi)穩(wěn)定性的前提。

文獻(xiàn)中引證了檢測(cè)寡核苷酸的不同方法，并且在公開的專利申請(qǐng)中也公開了這類方法，例如WO/2008/046645。許多已建立的定量和定性的寡核苷酸檢測(cè)方法均基于與互補(bǔ)寡核苷酸通過(guò)Watson-Crick堿基對(duì)的雜交。肽核酸(PNA)是寡核苷酸模擬物，其中通過(guò)N-氨乙基甘氨酸單體的假肽鏈置換糖骨架。它們通常用于基于探針的寡核苷酸檢測(cè)方法中，因?yàn)樗鼈円愿哂H和力、特異性和穩(wěn)定性與互補(bǔ)DNA或RNA序列結(jié)合(美國(guó)專利6,395,474)。WO/2008/046645提及了PNA探針在基于RT-PCT寡核苷酸檢測(cè)測(cè)試法中的用途。美國(guó)專利6,045,995描述了通過(guò)毛細(xì)管凝膠電泳的寡核苷酸定量和定性檢測(cè)。Rossi等描述了在陰離子高效液相色譜(HPLC)中通過(guò)PNA探針對(duì)PCR擴(kuò)增的寡核苷酸的鑒定(J.Agric.Food?Chem.2007，55，2509-2516)。

然而，多數(shù)現(xiàn)存的確定生物樣本中寡核苷酸的測(cè)試法不能檢測(cè)代謝物或不能區(qū)分代謝物信號(hào)和完整寡核苷酸產(chǎn)生的信號(hào)。例如，在基于PCR的方法中，通常僅產(chǎn)生完整藥物的信號(hào)，或作為與完整藥物一起的各種代謝物的總和產(chǎn)生信號(hào)。與熒光檢測(cè)聯(lián)合的毛細(xì)管凝膠電泳導(dǎo)致了完整寡核苷酸與其代謝物的定量分離，但這一方法在樣本制備階段需要提取和脫鹽步驟。此外，分析分子的回收是可變的，并且需要內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用于標(biāo)準(zhǔn)化。當(dāng)前使用的寡核苷酸檢測(cè)方法的另一主要限制是，在一個(gè)檢測(cè)中僅可檢測(cè)兩條鏈中的一條，這對(duì)于寡核苷酸雙鏈(例如，siRNA)檢測(cè)而言尤其不利。

因此，擁有能夠分析樣本中的寡核苷酸和其代謝物的檢測(cè)樣本中寡核苷酸的可重復(fù)且快速的方法是非常有利的。而且，考慮到siRNA和其衍生物在治療和診斷中的逐漸升高的重要性，需要有能夠在一次檢測(cè)中檢測(cè)寡核苷酸兩條鏈和其代謝物的可重復(fù)且快速的方法。

本發(fā)明公開了定性和定量檢測(cè)寡核苷酸的方法，包括以下步驟：選擇含有或懷疑含有所述寡核苷酸的樣本；通過(guò)使該樣本與熒光標(biāo)記的肽核酸(PNA)探針接觸形成雜交混合物，其中所述的肽核酸探針與所述寡核苷酸的至少10個(gè)或更多個(gè)核苷酸完全互補(bǔ)；通過(guò)陰離子交換高效液相色譜(aIEX-HPLC)將所述寡核苷酸和所述PNA探針形成的雜交部分與未雜交部分分開；以及通過(guò)熒光光譜法定性和/或定量檢測(cè)所述雜交部分。本發(fā)明與其他寡核苷酸檢測(cè)方法相比的主要優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)前的簡(jiǎn)單樣本制備，例如，不需要提純步驟、擴(kuò)增或提取步驟。因此，關(guān)于分析物回收的任何可變性均可避免。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在含有SDS的緩沖液中用蛋白酶K處理樣本，隨后用飽和KCl溶液沉淀SDS。由此有效避免樣本中寡核苷酸的降解。

過(guò)量的未雜交PNA探針在HPLC的空隙體積(void?volume)中洗脫，并且預(yù)期在梯度分離期間沒(méi)有來(lái)自該探針的干擾信號(hào)。因此，可應(yīng)用高度過(guò)量的PNA探針動(dòng)力學(xué)地控制雜交過(guò)程，無(wú)需建立從樣本中提取過(guò)量探針的步驟。PNA探針的應(yīng)用還消除了來(lái)自生物基質(zhì)的全部背景熒光，因?yàn)槠渑caIEX-HPLC的空隙體積一起洗脫。從PNA探針與來(lái)自生物基質(zhì)的RNA或DNA的非特異雜交產(chǎn)生的信號(hào)也在HPLC梯度的洗滌步驟中分別被洗脫。因此，在HPLC梯度期間僅能高度特異地檢測(cè)分析物特異信號(hào)。因此，即使上樣高生物學(xué)背景，aIEX-HPLX裝配也能健全地運(yùn)作。