[發(fā)明專(zhuān)利]小型振蕩瓶培養(yǎng)

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200980139382.3
• 申請(qǐng)日: 2009-10-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102171360A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: J·克魯茲曼;R·普斯凱勒;C·舒斯特
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 弗·哈夫曼-拉羅切有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12P21/00
• 分類(lèi)號(hào): C12P21/00;C12M1/36
• 代理公司: 北京市中咨律師事務(wù)所 11247
• 代理人: 黃革生;安佩東

本文報(bào)道了小型振蕩瓶培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，其中振蕩瓶?jī)?nèi)部培養(yǎng)基的條件通過(guò)振蕩瓶的旋轉(zhuǎn)速度和振蕩瓶的外部氣壓來(lái)控制。

發(fā)明背景

在開(kāi)發(fā)例用哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)重組多肽的生物技術(shù)生產(chǎn)工藝的過(guò)程中，有多個(gè)參數(shù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)和優(yōu)化。由于需要大量的單獨(dú)實(shí)驗(yàn)，這種優(yōu)化以小規(guī)模進(jìn)行，優(yōu)選在振蕩瓶中進(jìn)行。但由于大型攪拌培養(yǎng)器和小型振蕩瓶在幾何尺寸和反應(yīng)條件上的差異，得到的小規(guī)模的結(jié)果不代表大型工藝的真實(shí)結(jié)果。這些差異是由化學(xué)、生化和加工工程的原因引起的。

因此，總體目標(biāo)是找出小型和大型工藝的條件例如細(xì)胞密度、產(chǎn)品濃度或盡可能好的產(chǎn)品質(zhì)量之間的聯(lián)系。為了使大型工藝和小型工藝盡可能具有可比性，必須評(píng)估各種差異對(duì)獲得的結(jié)果的影響。例如，如果大型工藝是攪拌工藝，那么小型工藝最好也采用攪拌工藝。

DE4415444報(bào)道了振蕩瓶中攝氧速率在線(xiàn)測(cè)定的自動(dòng)測(cè)定系統(tǒng)。Kensy?F.等人(Biotechnol.Bioeng.89(2005)698-708)報(bào)道了48孔微量滴定板的氧傳遞現(xiàn)象。Nowack?G.等人(Am.Physio.Soc.(1996)C2072-C2080)報(bào)道了L-抗壞血酸調(diào)節(jié)腎細(xì)胞的生長(zhǎng)與新陳代謝。Randers-Eichhorn?L.等人(Biotechnol.Bioeng.51(1996)466-477)報(bào)道了在組織培養(yǎng)瓶中的非侵入性氧測(cè)量和傳質(zhì)考慮因素。Micheletti?M.等人(Chem.Eng.Sci.61(2006)2939-2949)報(bào)道了振蕩生物反應(yīng)器中的流體混合：對(duì)于微量型微生物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模擴(kuò)大化預(yù)測(cè)的意義。

因此，需要在小型振蕩瓶基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)大型攪拌哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝，反之亦然。另一個(gè)目標(biāo)是提供小型振蕩瓶工藝，在其中實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基攪動(dòng)和混合的小型機(jī)械攪拌。

發(fā)明概述

本發(fā)明的第一個(gè)方面是培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，包括：

-根據(jù)如下因素調(diào)節(jié)培養(yǎng)容器的機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度：

i)培養(yǎng)基中的活細(xì)胞密度，和/或

ii)培養(yǎng)基中的氧分壓。

在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法包括一個(gè)或多個(gè)以下步驟：

a)培養(yǎng)一套培養(yǎng)容器

-每一個(gè)容器的總?cè)莘e最高為200μl，或

-每一個(gè)容器的工作容積最高為100μl，或

-每一個(gè)容器的總?cè)莘e在25ml至3000ml之間，或

-每一個(gè)容器的工作容積在10ml至1500ml之間，和/或

b)通過(guò)整個(gè)培養(yǎng)容器的機(jī)械運(yùn)動(dòng)來(lái)攪動(dòng)培養(yǎng)基，

c)通過(guò)培養(yǎng)容器的外氣相的二氧化碳濃度來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值。

在一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)容器包含培養(yǎng)基和培養(yǎng)基上方的內(nèi)部氣相。在另一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)容器包含將內(nèi)部氣相和外部氣相分離的膜或帽或蓋。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方式中，機(jī)械運(yùn)動(dòng)通過(guò)整個(gè)培養(yǎng)容器的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)或整個(gè)培養(yǎng)容器的俯仰運(yùn)動(dòng)或整個(gè)培養(yǎng)容器的振蕩來(lái)實(shí)現(xiàn)。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法還包括：

d)通過(guò)非侵入性光化學(xué)傳感器確定培養(yǎng)容器內(nèi)的pH值和pO₂。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度的調(diào)節(jié)如下：

i)根據(jù)起始細(xì)胞密度將機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度設(shè)置為60rpm至100rpm，其中

當(dāng)細(xì)胞密度為1x10⁵細(xì)胞/ml或更小時(shí)設(shè)置為60rpm，

當(dāng)細(xì)胞密度為2.5x10⁵細(xì)胞/ml時(shí)設(shè)置為80rpm，

當(dāng)細(xì)胞密度為5x10⁵細(xì)胞/ml時(shí)設(shè)置為100rpm，

或在中間細(xì)胞密度時(shí)設(shè)置為線(xiàn)性中間值，

ii)活細(xì)胞密度每增加一倍，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度增加20rpm，直至細(xì)胞濃度達(dá)到20x10⁵細(xì)胞/ml，

iii)活細(xì)胞密度每增加20x10⁵細(xì)胞/ml，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度增加20rpm，直至細(xì)胞密度達(dá)到80x10⁵細(xì)胞/ml，

iv)活細(xì)胞密度由80x10⁵細(xì)胞/ml增加至細(xì)胞密度100x10⁵細(xì)胞/ml時(shí)，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度增加10rpm。

在一個(gè)實(shí)施方式中，機(jī)械運(yùn)動(dòng)的速度進(jìn)一步調(diào)節(jié)如下：

v)維持機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度在200rpm至210rpm之間，逐步降低機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度至135rpm，并保持該速度不變直到培養(yǎng)完成。